Prinzipien der konfokalen Mikroskopie
Das konfokale Mikroskop ist ein hochpräzises Bildgebungsinstrument, das in den 1980er Jahren entstand und entwickelt wurde und ein wesentliches wissenschaftliches Forschungsinstrument zur Untersuchung von Submikronstrukturen darstellt. Mit der Entwicklung von Computern, Bildverarbeitungssoftware und Lasern haben auch konfokale Mikroskope eine große Entwicklung durchlaufen und finden mittlerweile breite Anwendung in den Bereichen Biologie, Mikrosysteme und Materialmessung. Das konfokale Mikroskop ist ein neuer Mikroskoptyp, der das konfokale Prinzip, die Scantechnologie und die Computergrafikverarbeitungstechnologie vereint. Seine Hauptvorteile sind: hohe laterale Auflösung und hohe axiale Auflösung sowie effektive Unterdrückung von Streulicht bei hohem Kontrast.
Ein typischer Aufbau eines konfokalen Mikroskops besteht darin, zwei kleine Löcher auf der konjugierten Ebene der Brennebene des Messobjekts zu platzieren, von denen eines vor der Lichtquelle und das andere vor dem Detektor platziert wird, wie in Abbildung dargestellt 1. Aus der Abbildung ist ersichtlich, dass die vom Detektionsende gesammelte Lichtintensität am größten ist, wenn sich die gemessene Probe in der Quasi-Fokusebene befindet. Wenn sich die gemessene Probe außerhalb des Fokus befindet, diffundiert der Lichtfleck am Detektionsende und die Lichtintensität nimmt schnell ab. Daher kann nur das von Punkten auf der Brennebene emittierte Licht durch die Austrittslochblende gelangen, während das von Punkten außerhalb der Brennebene emittierte Licht auf der Austrittslochebene defokussiert wird und die meisten von ihnen nicht durch die zentrale Lochblende gelangen können. Daher erscheint der Beobachtungszielpunkt auf der Brennebene hell und der Nichtbeobachtungspunkt erscheint schwarz als Hintergrund, wodurch der Kontrast erhöht und das Bild klarer wird. Während des Bildgebungsprozesses sind die beiden Lochblenden konfokal, der konfokale Punkt ist der erfasste Punkt und die Ebene, in der sich der erfasste Punkt befindet, ist die konfokale Ebene.
Die Größe der Lochblende am Detektor spielt bei der konfokalen Mikroskopie eine entscheidende Rolle. Es wirkt sich direkt auf die Auflösung und das Signal-Rausch-Verhältnis des Systems aus. Wenn die Lochblende zu groß ist, wird der konfokale Detektionseffekt nicht erreicht, was nicht nur die Auflösung des Systems verringert, sondern auch mehr Streulicht einführt; Wenn die Lochblende zu klein ist, verringert sich die Erkennungseffizienz und das mikroskopische Bild. Helligkeit. Studien haben gezeigt, dass, wenn der Durchmesser der Lochblende dem Durchmesser der Airy-Scheibe entspricht, die konfokalen Anforderungen erfüllt sind und die Detektionseffizienz nicht wesentlich verringert wird. Da der Durchmesser der Lochblende im Allgemeinen in der Größenordnung von Mikrometern liegt, kommt es bei einer Abweichung zwischen dem Fokuspunkt des Laserstrahls und der Position der Lochblende zu Signalverzerrungen. Daher verwenden konfokale Mikroskope in der Regel ein Autofokussystem, was die Messzeit geradezu verlängert.
Da es sich bei dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop um eine Punktbildgebung handelt, ist es zum Erhalten eines zweidimensionalen Bildes des Objekts erforderlich, ein zweidimensionales Scannen in x- und y-Richtung zu verwenden. Verschiedene Mikroskope verwenden unterschiedliche Scanverfahren:
(1) Objektscan. Das heißt, das Objekt selbst bewegt sich nach einem bestimmten Gesetz, während der Lichtstrahl unverändert bleibt. Vorteile: stabiler optischer Pfad; Nachteile: Es ist ein großer Scantisch erforderlich, daher ist die Scangeschwindigkeit stark eingeschränkt.
(2) Ein Strahlabtastsystem wird unter Verwendung eines reflektierenden Galvanometers gebildet. Das heißt, durch die Steuerung des Scan-Galvanometers wird der fokussierte Lichtpunkt regelmäßig auf eine bestimmte Schicht des Objekts reflektiert, um das zweidimensionale Scannen abzuschließen. Sein Vorteil besteht darin, dass es eine hohe Präzision aufweist und häufig für hochpräzise Messungen verwendet wird. Die Scangeschwindigkeit hat sich im Vergleich zum Objektscannen verbessert, ist aber immer noch nicht hoch.
(3) Verwenden Sie zum Scannen das akusto-optische Ablenkelement. Das Scannen wird durch Ändern der Ausgangsfrequenz der Schallwelle und anschließendes Ändern der Übertragungsrichtung der Lichtwelle realisiert. Sein herausragender Vorteil ist, dass die Scangeschwindigkeit sehr hoch ist. Das von den USA entwickelte Scansystem verwendet einen akusto-optischen Deflektor, um Echtzeit-Videobilder zu erzeugen. Das Scannen eines zweidimensionalen Bildes dauert nur 1/30 Sekunde und erreicht nahezu eine Echtzeitausgabe.
(4) Scannen der Nipkow-Festplatte. Der Scanvorgang wird abgeschlossen, indem die Nipkow-Scheibe gedreht wird, während andere Komponenten still gehalten werden. Es kann auf einmal abgebildet werden und die Geschwindigkeit ist sehr hoch. Da es sich bei dem Abbildungsstrahl jedoch um außeraxiales Licht handelt, muss die außeraxiale Aberration der Linse korrigiert werden, und der Nutzungsgrad der Lichtenergie ist sehr gering.
