Der Unterschied zwischen (Zwei-Photon, konfokaler) Fluoreszenzmikroskop und gewöhnlichem Mikroskop
Das Grundprinzip der Zwei-Photonen-Anregung besteht darin, dass bei hoher Photonendichte fluoreszierende Moleküle gleichzeitig zwei lange Wellenlängenphotonen absorbieren und nach einer kurzen Zeit der Lebensdauer des sogenannten angeregten Zustands ein kürzeres Wellenlängenphoton emittieren können; Der Effekt ist der gleiche wie die Verwendung eines Photons mit der Hälfte der Wellenlänge der langen Wellenlänge, um fluoreszierende Moleküle zu erregen. Zwei Photonenanregungen erfordern eine hohe Photonendichte, und um schädliche Zellen zu vermeiden, verwendet die Zwei-Photon-Mikroskopie mit hohen Energienmodus-Lasern mit Moden, die gekauft werden. Der von diesem Laser emittierte Laser weist eine hohe Spitzenergie und eine niedrige durchschnittliche Energie mit einer Impulsbreite von nur 100 Femtosekunden und einer Häufigkeit von bis zu 80 bis 100 Megahertz auf. Bei der Verwendung einer objektiven Linse mit hoher numerischer Apertur, um die Photonen eines gepulsten Lasers zu fokussieren, ist die Photonendichte am Brennpunkt der objektiven Linse die höchste und zwei-photonische Anregung tritt nur am Brennpunkt der objektiven Linse auf. Daher erfordert das Zwei-Photonen-Mikroskop kein konfokales Loch, das die Effizienz der Fluoreszenzerkennung verbessert.
Im Allgemeinen fluoreszenzphänomen kann ein fluoreszierendes Molekül aufgrund der geringen Photonendichte des Anregungslichts jeweils nur ein Photon absorbieren und dann einen anderen fluoreszierenden Photon durch Strahlungsübergang emittieren, das als Einzelphotonenfluoreszenz bekannt ist. Bei Fluoreszenzanregungsprozessen unter Verwendung von Lasern als Lichtquellen können Zwei-Photonen- oder sogar Multiphotonen-Fluoreszenzphänomene auftreten. In diesem Fall weist die verwendete Anregungslichtquelle eine hohe Intensität und Photonendichte auf, die den Anforderungen an fluoreszierende Moleküle erfüllt, um zwei Photonen gleichzeitig zu absorbieren. Bei der Verwendung eines allgemeinen Lasers als Anregungslichtquelle reicht die Photonendichte immer noch nicht aus, um ein Zwei-Photon-Absorptionsphänomen zu erzeugen. Typischerweise werden Femtosekunden -Pulslaser verwendet, wobei sofortige Kraft den Megawatt -Level erreicht. Daher ist die Wellenlänge der Zwei-Photonen-Fluoreszenz kürzer als die des Anregungslichts, was dem Effekt entspricht, der durch die halbe Anregung der Wellenlänge erzeugt wird.
Kenntnisse im Zusammenhang mit einer konfokalen Fluoreszenzmikroskopie
Das Grundprinzip der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie besteht darin, eine Punktlichtquelle zur Bestrahlung der Probe zu verwenden und einen gut definierten kleinen Lichtfleck auf der Fokusebene zu bilden. Die Fluoreszenz, die nach der Bestrahlung aus dieser Stelle emittiert wird, wird durch die objektive Linse gesammelt und entlang des ursprünglichen Bestrahlungswegs zum Strahlsplitter zurückgeschickt, der aus einem dichroischen Spiegel besteht. Das Spektrometer sendet Fluoreszenz direkt an den Detektor. Vor der Lichtquelle als auch des Detektors befindet sich ein Loch, das Beleuchtungsstich und das Erkennungsspinloch bezeichnet. Die geometrischen Dimensionen der beiden sind konsistent, ungefähr 100-200 nm; Im Vergleich zu dem leichten Fleck auf der Brennebene sind die beiden konjugiert, was bedeutet, dass der Lichtfleck durch eine Reihe von Linsen fließt und sich letztendlich sowohl auf das Beleuchtungsstichloch als auch das Erkennungsspinloch gleichzeitig konzentrieren kann. Auf diese Weise kann Licht aus der Brennebene im Bereich des Erkennungslochs konvergieren, während verstreute Licht von oberhalb oder unterhalb der Brennebene außerhalb des Nachweislochs blockiert ist und nicht abgebildet werden kann. Das Scannen des Probens mit einem Laser scannt nach dem Erkennen des Lochlochs nach dem Erkennen des Pinlochs auch das entsprechende konfokale Bild des Lichtspindungspunkts für Punkt, verwandelt es in ein digitales Signal und überträgt es auf den Computer und aggregiert schließlich in ein klares konfokales Bild der gesamten Fokusebene auf der Bildschirm.
