Prinzip und Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie
(1) Das Prinzip und die strukturellen Eigenschaften des Fluoreszenzmikroskops: Das Fluoreszenzmikroskop verwendet eine Punktlichtquelle mit hoher Lichtausbeute, um Licht einer bestimmten Wellenlänge (z. B. ultraviolettes Licht 3650 Zoll oder violett-blaues Licht 4200 Zoll) durch das Filtersystem zu emittieren als Anregungslicht zur Anregung der Probe. Nachdem die fluoreszierende Substanz im Inneren Fluoreszenz in verschiedenen Farben emittiert, wird diese durch die Vergrößerung des Objektivs und des Okulars beobachtet. Auf diese Weise ist es vor einem kontrastreichen Hintergrund selbst bei sehr schwacher Fluoreszenz leicht zu identifizieren und weist eine hohe Empfindlichkeit auf. Es wird hauptsächlich zur Erforschung der Zellstruktur und -funktion sowie der chemischen Zusammensetzung verwendet. Der Grundaufbau eines Fluoreszenzmikroskops besteht aus einem gewöhnlichen optischen Mikroskop und einigen Zubehörteilen (z. B. einer Fluoreszenzlichtquelle, einem Anregungsfilter, einem Zweifarben-Strahlteiler und einem Sperrfilter usw.). Fluoreszierende Lichtquelle – im Allgemeinen wird eine Ultrahochdruck-Quecksilberlampe (50-200W) verwendet, die Licht verschiedener Wellenlängen emittieren kann, aber jede fluoreszierende Substanz hat eine Anregungswellenlänge, die die stärkste Fluoreszenz erzeugt, daher ist es notwendig, eine hinzuzufügen Anregungsfilter (Im Allgemeinen gibt es ultraviolette, violette, blaue und grüne Anregungsfilter), die nur Anregungslicht einer bestimmten Wellenlänge durchlassen und die Probe bestrahlen lassen, während sie anderes Licht absorbieren. Nachdem jede Substanz mit Anregungslicht bestrahlt wurde, emittiert sie in sehr kurzer Zeit sichtbare Fluoreszenz mit einer längeren Wellenlänge als der Bestrahlungswellenlänge. Fluoreszenz ist spezifisch und im Allgemeinen schwächer als Anregungslicht. Um spezifische Fluoreszenz zu beobachten, ist hinter der Objektivlinse ein Sperrfilter (oder Unterdrückungsfilter) erforderlich. Es hat zwei Funktionen: Eine besteht darin, das Anregungslicht zu absorbieren und daran zu hindern, in das Okular einzudringen, um die Fluoreszenz nicht zu stören und die Augen zu schädigen. Die andere besteht darin, die spezifische Fluoreszenz auszuwählen und durchzulassen, wodurch eine bestimmte fluoreszierende Farbe angezeigt wird. Die beiden Filter müssen zusammen verwendet werden.
Hinsichtlich ihres Strahlengangs unterscheidet man zwei Arten von Fluoreszenzmikroskopen:
1. Transmissionsfluoreszenzmikroskop: Die Anregungslichtquelle regt über die Kondensorlinse Fluoreszenz durch das Probenmaterial an. Üblicherweise wird ein Dunkelfeldkollektor verwendet, und ein gewöhnlicher Kollektor kann auch verwendet werden, um den Spiegel so einzustellen, dass das Anregungslicht durchgelassen und an der Probe vorbeigeleitet wird. Dies ist ein altmodisches Fluoreszenzmikroskop. Der Vorteil besteht darin, dass die Fluoreszenz bei geringer Vergrößerung stark ist, und der Nachteil besteht darin, dass die Fluoreszenz mit zunehmender Vergrößerung abnimmt. Daher eignet es sich besser für die Beobachtung größerer Probenmaterialien.
2. Epi-Fluoreszenzmikroskop Dies ist ein neuer Typ eines Fluoreszenzmikroskops, der in der Neuzeit entwickelt wurde. Der Unterschied besteht darin, dass das Anregungslicht von der Objektivlinse auf die Oberfläche der Probe fällt, d. h. dieselbe Objektivlinse wird als Beleuchtungskondensor und als Objektivlinse zum Sammeln der Fluoreszenz verwendet. Im Lichtweg muss ein dichroitischer Strahlteiler hinzugefügt werden, der 45 Grad vom hellen Uran entfernt ist. Das Anregungslicht wird in die Objektivlinse reflektiert und auf der Probe gesammelt. Die von der Probe erzeugte Fluoreszenz und das von der Linsenoberfläche der Objektivlinse und der Deckglasoberfläche reflektierte Anregungslicht treten gleichzeitig in die Objektivlinse ein und kehren zum Zweifarbenstrahlteiler zurück, um das Anregungslicht von der Fluoreszenz zu trennen , restliches Anregungslicht wird durch Sperrfilter absorbiert. Wenn Sie auf eine Kombination verschiedener Anregungsfilter/Zweifarbstrahlteiler/Sperrfilter umsteigen, können die Anforderungen verschiedener Fluoreszenzreaktionsprodukte erfüllt werden. Der Vorteil dieser Art von Fluoreszenzmikroskop besteht darin, dass die Ausleuchtung des Sichtfeldes gleichmäßig ist, die Abbildung klar ist und die Fluoreszenz umso stärker ist, je größer die Vergrößerung ist.
(2) Verwendung des Fluoreszenzmikroskops.
1. Schalten Sie die Lichtquelle ein. Die Ultrahochdruck-Quecksilberlampe muss sich einige Minuten lang aufwärmen, um den hellsten Punkt zu erreichen.
2. Für das Transmissionsfluoreszenzmikroskop sollte der erforderliche Anregungsfilter zwischen Lichtquelle und Kondensor und der entsprechende Sperrfilter hinter der Objektivlinse installiert werden. Bei Epi-Fluoreszenzmikroskopen müssen die erforderlichen Anregungsfilter/Zweifarbstrahlteiler/Sperrfiltereinsätze in die Schlitze im Lichtweg eingesetzt werden.
3. Beobachten Sie mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung und stellen Sie die Mitte der Lichtquelle entsprechend der Einstellvorrichtung verschiedener Arten von Fluoreszenzmikroskopen so ein, dass sie sich in der Mitte des gesamten Beleuchtungsflecks befindet.
4. Platzieren Sie das Probenblatt und beobachten Sie es nach der Fokussierung. Bei der Anwendung ist zu beachten: Nicht direkt mit dem Endfilter beobachten, um Augenschäden zu vermeiden; Bei der Beobachtung der Probe mit einer Öllinse muss eine spezielle Öllinse ohne Fluoreszenz verwendet werden; Nachdem die Hochdruck-Quecksilberlampe ausgeschaltet wurde, kann sie nicht sofort wieder eingeschaltet werden und muss getestet werden. Es kann nach 5 Minuten neu gestartet werden, da es sonst instabil wird und die Lebensdauer der Quecksilberlampe beeinträchtigt.
(3) Beobachtung Unter Verwendung eines blauvioletten Lichtfilters unter einem Fluoreszenzmikroskop auf der Lehrplattform kann man sehen, dass die mit 0,01 Prozent Acridinorange-Fluoreszenzfarbstoff gefärbten Zellen, der Zellkern und das Zytoplasma angeregt werden, zwei verschiedene Farben zu erzeugen Fluoreszenz (dunkel)grün und orangerot).
