Multiphotonenmikroskopische Bildgebung: Verschiedene Techniken zur Abbildung von Neuronen in vivo
Im Vergleich zum herkömmlichen Einzelphotonen-Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop verfügt die Multiphotonenmikroskopie (MPM) über die Funktionen optischer Schnitte und Tiefenbildgebung. Im Jahr 2019 haben Jerome Lecoq et al. diskutierte die verwandte MPM-Technologie unter drei Aspekten: Neuronenbildgebung tief im Gehirn, massive Neuronenbildgebung und Hochgeschwindigkeitsneuronenbildgebung.
Um die Neuronenaktivität mit komplexem Verhalten zu verknüpfen, ist es normalerweise notwendig, Neuronen im tiefen Kortex abzubilden, was erfordert, dass MPM über die Fähigkeit zur Tiefenabbildung verfügt. Anregungs- und Emissionslicht werden von biologischem Gewebe stark gestreut und absorbiert, was der Hauptfaktor ist, der die Bildtiefe von MPM begrenzt. Obwohl das Streuproblem durch Erhöhen der Laserintensität gelöst werden kann, bringt es andere Probleme mit sich, wie z. B. das Verbrennen der Probe, Defokussierung und oberflächennahe Fluoreszenzanregung. Der beste Weg, die Tiefe der MPM-Bildgebung zu erhöhen, besteht darin, längere Wellenlängen als Anregungslicht zu verwenden.
Darüber hinaus sind bei der Zwei-Photonen-(2P)-Bildgebung außerfokussierte und oberflächennahe Fluoreszenzanregung die beiden größten tiefenbegrenzenden Faktoren, während bei der Drei-Photonen-(3P)-Bildgebung diese beiden Probleme stark reduziert sind Drei-Photonen-Bildgebung aufgrund von Fluoreszenz Der Absorptionsquerschnitt der Gruppe ist viel kleiner als der von 2P, daher ist eine um eine Größenordnung höhere Pulsenergie erforderlich, um das gleiche Intensitätsfluoreszenzsignal wie das von 2P angeregte zu erhalten. Die funktionelle 3P-Mikroskopie ist anspruchsvoller als die strukturelle 3P-Mikroskopie, die ein schnelleres Scannen erfordert, um die neuronale Aktivität rechtzeitig zu erfassen. Um innerhalb der Verweilzeit jedes Pixels ausreichend Signale zu sammeln, ist eine höhere Pulsenergie erforderlich.
An komplexen Verhaltensweisen sind häufig große Gehirnnetzwerke mit sowohl lokalen als auch weitreichenden Verbindungen beteiligt. Um die Neuronenaktivität mit dem Verhalten zu verknüpfen, ist es notwendig, die Aktivität sehr großer und weit verteilter Neuronen gleichzeitig zu überwachen. Das neuronale Netzwerk im Gehirn verarbeitet eingehende Reize innerhalb von mehreren zehn Millisekunden. Um dieses schnelle neuronale Netzwerk zu verstehen und die Neuronendynamik zu untersuchen, muss MPM in der Lage sein, Neuronen schnell abzubilden. Schnelle MPM-Methoden können in Einzelstrahl-Scantechniken und Mehrstrahl-Scantechniken unterteilt werden.
Die Einzelstrahl-Scantechnologie ermöglicht die Hochgeschwindigkeitsdurchquerung von Nervengewebe mit einem großen Sichtfeld (FOV).
Bei der Verwendung von MPM zur Abbildung von Neuronen kann das Direktzugriffsscannen – das heißt, der Laserstrahl wird schnell an jedem ausgewählten Punkt im gesamten Sichtfeld gescannt – nur die interessierenden Neuronen scannen, wodurch nicht nur das Scannen unbeschrifteter Nervenfasern vermieden werden kann Optimieren Sie außerdem die Scanzeit des Laserstrahls. Das Scannen mit wahlfreiem Zugriff (Abb. 1) kann mit einem akusto-optischen Deflektor (AOD) erreicht werden, der durch die Verbindung eines piezoelektrischen Wandlers mit einem Hochfrequenzsignal mit einem geeigneten Kristall funktioniert. Die resultierenden akustischen Wellen induzieren ein periodisches Brechungsindexgitter. Beugung tritt auf, wenn ein Laserstrahl ein Gitter passiert. Die Intensität und Frequenz der Schallwelle kann durch das elektrische Hochfrequenzsignal angepasst werden, um die Intensität und Richtung des gebeugten Lichts zu ändern, sodass mit einem AOD ein eindimensionales horizontales Scannen beliebiger Punkte und 3D realisiert werden können durch die Verwendung eines AOD-Paares in Kombination mit anderen axialen Scantechnologien, Direktzugriffsscannen. Diese Technik reagiert jedoch sehr empfindlich auf die Bewegung der Probe und ist anfällig für Bewegungsartefakte. Derzeit wird häufig schnelles Rasterscannen, also progressives Scannen im Sichtfeld, verwendet, da der Algorithmus die Bewegungsartefakte leicht beheben kann.
AOD-basierte Zwei-Photonen-Bildgebung neokortikaler L2/3-Neuronen in vivo[2]
Es gibt viele Möglichkeiten, ein schnelles Rasterscannen zu realisieren, z. B. die Verwendung eines Vibrationsspiegels für schnelles 2D-Scannen, die Kombination eines Vibrationsspiegels und einer einstellbaren elektrischen Linse für schnelles 3D-Scannen, aber die einstellbare elektrische Linse kann aufgrund der Einschränkung nicht schnell in axialer Richtung fokussieren Die mechanische Trägheitsschaltung, die sich auf die Bildgeschwindigkeit auswirkt, kann jetzt durch einen räumlichen Lichtmodulator (SLM) ersetzt werden.
Fernfokussierung ist auch ein Mittel zur Erzielung einer 3D-Bildgebung, wie in Abbildung 2 dargestellt. Im LSU-Modul scannt das Scan-Galvanometer horizontal, und das ASU-Modul umfasst die Objektivlinse L1 und den Spiegel M, und das axiale Scannen wird durch Anpassen realisiert die Position von M. Diese Technik kann nicht nur die durch die Hauptobjektivlinse L2 verursachte optische Aberration korrigieren, sondern auch ein schnelles axiales Scannen ermöglichen. Um mehr Neuronenabbildung zu erhalten, kann das FOV durch Anpassen des Objektivlinsendesigns des Mikroskops vergrößert werden. Die Objektivlinse mit großer NA und großem FOV ist jedoch normalerweise schwer und kann sich für schnelles axiales Scannen nicht schnell bewegen, sodass Systeme mit großem FOV auf Telefokus angewiesen sind , SLM und verstellbare motorisierte Objektive.
Schematische Darstellung eines fernfokussierenden Zwei-Photonen-Bildgebungssystems[3] Die Mehrstrahl-Scanning-Technologie kann gleichzeitig verschiedene Positionen von neuronalem Gewebe abbilden
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm voneinander entfernt) Bildgebungsorte (Abb. 3C, D); Für benachbarte Regionen werden normalerweise mehrere Strahlen einer einzelnen Objektivlinse zur Bildgebung verwendet (Abb. 3E, F). Bei der Mehrstrahl-Scantechnik muss dem Übersprechproblem zwischen den Anregungsstrahlen besondere Aufmerksamkeit gewidmet werden, das durch die Methode der Trennung nach der Lichtquelle oder die Raum-Zeit-Multiplexmethode gelöst werden kann. Die Post-hoc-Lichtquellentrennungsmethode bezieht sich auf die Verwendung von Algorithmen zur Trennung der Strahlen, um Übersprechen zu vermeiden. Das Zeit-Raum-Multiplexverfahren bezieht sich auf die gleichzeitige Verwendung mehrerer Anregungsstrahlen. Die Impulse jedes Strahls werden zeitlich verzögert, sodass die einzelnen von verschiedenen Strahlen angeregten Strahlen vorübergehend getrennt werden können. Fluoreszenzsignal. Durch die Einführung weiterer Strahlen können mehr Neuronen abgebildet werden, aber mehrere Strahlen erhöhen die Überlappung der Fluoreszenzabklingzeit, was die Fähigkeit zur Unterscheidung von Signalquellen einschränkt; und Multiplexing wirkt sich negativ auf die Arbeitsgeschwindigkeit elektronischer Geräte aus. Hohe Anforderungen; Eine große Anzahl von Strahlen erfordert außerdem eine höhere Laserleistung, um ein ungefähres Signal-Rausch-Verhältnis eines einzelnen Strahls aufrechtzuerhalten, was leicht zu Gewebeschäden führen kann.
Großflächige Bildgebungstechnologie
In den letzten Jahren hat die Entwicklung verschiedener MPM-Technologien den Anwendungsbereich unserer Bildgebung von Nervengewebe erweitert und es uns ermöglicht, mehr Neuronen tief im Gehirn schneller abzubilden, was die neurowissenschaftliche Forschung erheblich gefördert und es uns ermöglicht hat, ein klareres Verständnis zu erlangen der Gehirnfunktion.
