Mikroskopische Einteilung und Arbeitsprinzip für die Zellforschung
Das Mikroskop ist das wichtigste Werkzeug zur Beobachtung von Zellen. Je nach Lichtquelle kann es in zwei Kategorien eingeteilt werden: Lichtmikroskope und Elektronenmikroskope. Ersteres verwendet sichtbares Licht (UV-Mikroskope verwenden ultraviolettes Licht) als Lichtquelle, während letzteres Elektronenstrahlen als Lichtquelle verwendet.
-,Optisches Mikroskop
(1) Gewöhnliches optisches Mikroskop
Gewöhnliche biologische Mikroskope bestehen aus drei Teilen, nämlich: ① Beleuchtungssystem, einschließlich Lichtquelle und Kondensor; ② optisches Vergrößerungssystem, bestehend aus Objektiv und Okular, das der Hauptkörper des Mikroskops ist. Um sphärische Aberration und chromatische Aberration zu eliminieren, sind sowohl das Okular als auch das Objektiv ③Mechanische Vorrichtung, die verwendet wird, um das Material zu fixieren und die Beobachtung zu erleichtern (Abbildung 2-1).
Ob das Mikroskopbild scharf ist, hängt nicht nur von der Vergrößerung ab, sondern auch von der Auflösung des Mikroskops. Die Auflösung bezieht sich auf die Fähigkeit des Mikroskops (oder des menschlichen Auges, 25 cm vom Ziel entfernt zu sein), den kleinsten Abstand zwischen Objekten zu unterscheiden. Die Größe der Auflösung wird bestimmt durch Die Wellenlänge und das Öffnungsverhältnis des Lichts und der Brechungsindex des Mediums werden durch die Formel ausgedrückt:
In der Formel: n=Brechungsindex des Mediums;=Öffnungswinkel (Öffnungswinkel der Probe zur Objektivlinsenöffnung), NA=Linsenöffnung (numerische Apertur). Der Linsenwinkel ist immer kleiner als 180 Grad, daher muss der Maximalwert von sina/2 kleiner als 1 sein.
Der Brechungsindex des zur Herstellung der optischen Linse verwendeten Glases beträgt 1,65 bis 1,78, und je näher der Brechungsindex des verwendeten Mediums am Glas liegt, desto besser. Bei trockenen Objektiven ist das Medium Luft, und das Öffnungsverhältnis der Linse beträgt im Allgemeinen 0.05 bis 0,95; Für Öllinsen wird Zedernöl als Medium verwendet, und das Öffnungsverhältnis der Linse kann nahe bei 1,5 liegen.
Die Wellenlänge des gewöhnlichen Lichts beträgt {{0}} nm, sodass der Auflösungswert des Mikroskops nicht weniger als 0,2 μm beträgt und die Auflösung des menschlichen Auges 0,2 mm beträgt Die maximale Vergrößerung des allgemeinen Mikroskopdesigns beträgt normalerweise 1000X.
(2) Fluoreszenzmikroskopie
Einige Substanzen in Zellen, wie Chlorophyll, können fluoreszieren, nachdem sie mit ultravioletten Strahlen bestrahlt wurden; Einige Substanzen selbst können nicht fluoreszieren, aber wenn sie mit fluoreszierenden Farbstoffen oder fluoreszierenden Antikörpern angefärbt werden, können sie auch fluoreszieren, wenn sie mit ultravioletten Strahlen bestrahlt werden, und das Fluoreszenzmikroskop (Abb. 2-2, 3, 4) ist eines der Werkzeuge für die qualitative und quantitative Erforschung solcher Substanzen.
Fluoreszenzmikroskope und gewöhnliche Mikroskope haben folgende Unterschiede:
1. Die Beleuchtungsmethode ist normalerweise die Auflichtbeleuchtung, d. h. die Lichtquelle wird durch die Objektivlinse auf die Probe projiziert (Abbildung 2-3);
2. Die Lichtquelle ist ultraviolettes Licht, die Wellenlänge ist kürzer und die Auflösung ist höher als die von gewöhnlichen Mikroskopen;
3. Es gibt zwei spezielle Filter, der vor der Lichtquelle dient zum Herausfiltern des sichtbaren Lichts und der zwischen dem Okular und der Objektivlinse dient zum Herausfiltern des ultravioletten Lichts, um die Augen zu schützen.
(3) Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (konfokales Laser-Scanning-Mikroskop, Abbildung 2-5, 6) verwendet einen Laser als Scanning-Lichtquelle und scannt die Bildgebung Punkt für Punkt, Linie für Linie, Oberfläche für Oberfläche, und die Scanning-Laser- und Fluoreszenzsammlung teilen sich ein Objektivlinse, und der Brennpunkt der Objektivlinse ist Der Brennpunkt des Abtastlasers ist auch der Objektpunkt der Momentaufnahme. Da die Wellenlänge des Laserstrahls kurz und der Strahl sehr dünn ist, hat das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop eine höhere Auflösung, die etwa dreimal so hoch ist wie die eines gewöhnlichen optischen Mikroskops. Das System wird einmal fokussiert und der Scan auf eine Ebene der Probe begrenzt. Wenn die Fokussiertiefe unterschiedlich ist, können Bilder unterschiedlicher Tiefenniveaus der Probe erhalten werden. Diese Bildinformationen werden im Computer gespeichert. Durch Computeranalyse und Simulation kann die dreidimensionale Struktur der Zellprobe dargestellt werden.
Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie kann nicht nur zur Beobachtung der Zellmorphologie, sondern auch zur quantitativen Analyse intrazellulärer biochemischer Komponenten, zur Statistik der optischen Dichte und zur Messung der Zellmorphologie verwendet werden.
(4) Dunkelfeldmikroskop
Das Dunkelfeldmikroskop (Dunkelfeldmikroskop, Abbildung 2-7) hat in der Mitte des Kondensors eine Lichtscheibe, damit das Beleuchtungslicht nicht direkt in die menschliche Linse eintritt, sondern nur das Licht, das von der Probe reflektiert und gebeugt wird in das Objektiv eindringen kann, so dass der Hintergrund des Sichtfelds schwarz ist, die Kanten von Objekten hell sind. Mit diesem Mikroskop können Partikel bis zu einer Größe von 4-200 nm gesehen werden, und die Auflösung kann 50-mal höher sein als die von gewöhnlichen Mikroskopen.
(5) Phasenkontrastmikroskop
Das Phasenkontrastmikroskop (Phasenkontrastmikroskop, Abbildung 2-8, 9) von P. Zernike wurde 1932 erfunden und erhielt dafür 1953 den Nobelpreis für Physik. Das größte Merkmal dieses Mikroskops ist, dass es ungefärbte Proben und lebende Zellen beobachten kann.
Das Grundprinzip der Phasenkontrastmikroskopie besteht darin, den optischen Gangunterschied des durch die Probe tretenden sichtbaren Lichts in einen Amplitudenunterschied umzuwandeln, wodurch der Kontrast zwischen verschiedenen Strukturen verbessert und verschiedene Strukturen deutlich sichtbar gemacht werden. Nach dem Durchgang durch die Probe wird das Licht gebrochen, vom ursprünglichen Strahlengang abgelenkt und um 1/4λ (Wellenlänge) verzögert. Amplitude verstärken, erhöhen oder verringern, Kontrast erhöhen. Phasenkontrastmikroskope weisen vom Aufbau her zwei Besonderheiten auf, die sich von gewöhnlichen Lichtmikroskopen unterscheiden:
1. Die ringförmige Blende befindet sich zwischen der Lichtquelle und dem Kondensor, und ihre Funktion besteht darin, das durch den Kondensor tretende Licht dazu zu bringen, einen hohlen Lichtkegel zu bilden und auf die Probe zu fokussieren.
2. Die Phasenplatte (ringförmige Phasenplatte) fügt eine mit Magnesiumfluorid beschichtete Phasenplatte in die Objektivlinse ein, die die Phase von direktem oder gebeugtem Licht um 1/4λ verzögern kann. Es gibt zwei Arten:
①A plus Phasenplatte: Das direkte Licht wird um 1/4λ verzögert. Nachdem die zwei Gruppen von Lichtwellen kombiniert wurden, werden die Lichtwellen addiert und die Amplitude wird erhöht. Die Struktur der Probe ist heller als das umgebende Medium und bildet einen hellen Kontrast (oder negativen Kontrast).
② B plus Phasenplatte: Das gebeugte Licht wird um 1/4λ verzögert. Nachdem die beiden Strahlensätze kombiniert wurden, werden die Lichtwellen subtrahiert und die Amplitude wird kleiner, wodurch ein dunkler Kontrast (oder positiver Kontrast) entsteht, und die Struktur ist dunkler als das umgebende Medium.
(6) Polarisationsmikroskop
Das Polarisationsmikroskop wird verwendet, um Substanzen mit Doppelbrechung wie Filamente, Spindeln, Kollagen, Chromosomen usw. nachzuweisen. Der Unterschied zu gewöhnlichen Mikroskopen besteht darin, dass sich vor der Lichtquelle ein Polarisator (Polarisator) befindet, sodass das in das Mikroskop eintretende Licht polarisiertes Licht ist, und dass sich darin ein Analysator (ein Polarisator, dessen Polarisationsrichtung senkrecht zum Polarisator steht) befindet der Objektivtubus. Der Objekttisch dieses Mikroskops ist drehbar. Wenn eine einfach brechende Substanz auf dem Objekttisch platziert wird, kann, egal wie der Objekttisch gedreht wird, kein Licht im Mikroskop gesehen werden, da die beiden Polarisatoren vertikal sind, und das Licht ist im Mikroskop nicht sichtbar. Beim Eintritt in doppelbrechende Materialien kann der Drehtisch solche Objekte erkennen, da Licht beim Durchgang durch solche Materialien abgelenkt wird.
