Klassenzimmer für mikroskopische Bildgebung丨Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie
Die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ist eine Technik, die die evaneszente Welle nutzt, die von einem Lichtstrahl erzeugt wird, der sich zwischen zwei Medien mit unterschiedlichem Brechungsindex ausbreitet, um die Oberfläche fluoreszierend markierter lebender Zellen zu untersuchen. Wenn in der Praxis ein einfallender Laserstrahl auf die Grenzfläche zwischen dem Deckglas und dem wässrigen Medium mit den Zellen trifft, wird er im kritischen Winkel reflektiert (totale interne Reflexion). Da die Energie der evaneszenten Welle exponentiell mit der Entfernung vom Deckglas abnimmt, werden nur Fluorophore innerhalb von 10 Nanometern der Oberfläche (zwischen 10 und 200 Nanometern) von der evaneszenten Welle angeregt, während weiter entfernte Fluorophore weitgehend nicht angeregt werden. Betroffen. Daher führt TIRFM zu hohen Signalpegeln von Fluorophoren, die sich in der Nähe des Deckglases befinden und auf einem sehr dunklen Hintergrund überlagert sind, was zu einem hervorragenden Signal-Rausch-Verhältnis führt. Die extreme Begrenzung der Anregungstiefe ist ideal für die Untersuchung einzelner Moleküle oder der Membran- und Organellenzusammensetzung in adhärenten Zellen in der Nähe der Deckglasoberfläche (siehe Abbildung 8(e)). Da die Anregung auf dünne Bereiche in der Nähe des Deckglases beschränkt ist, sind Photobleichung und Phototoxizität ebenfalls auf diese Bereiche beschränkt, was TIRFM zu einer der nützlichsten Methoden für Langzeitbeobachtungen macht. Die Technik ist zu einem grundlegenden Werkzeug für die Untersuchung einer Vielzahl von Phänomenen in der Zell- und Molekularbiologie geworden.
Bei der Dekonvolution handelt es sich um einen Algorithmus, der auf eine Reihe von Allfokusbildern angewendet wird, die entlang der optischen (Z)-Achse aufgenommen wurden, um das Photonensignal in einem Bildstapel für eine bestimmte Bildebene oder mehrere Fokusebenen zu verstärken. Mikroskope müssen mit hochpräzisen motorischen Fokusantrieben ausgestattet sein, um eine Bildaufnahme in genau definierten Abständen zwischen den Fokusebenen der Probe zu gewährleisten. In einer typischen Anwendung (siehe Abb. 8(f)) wird der Entfaltungsprozess verwendet, um unscharfes Licht aus einer bestimmten Fokusebene mithilfe von Weitfeld-Fluoreszenzanregung und -emission zu entschärfen und zu entfernen. Die komplexeste Anwendung besteht darin, den Entfaltungsprozess auf den gesamten Bildstapel anzuwenden, um projizierte Ansichten oder 3D-Modelle zu erzeugen. Eine Reihe von Weitfeldbildern, die für die Entfaltung verwendet werden, erfasst die theoretische maximale Anzahl der von der Probe emittierten Photonen. Durch den Entfaltungsprozess werden die „unscharfen“ Intensitäten der über und unter der Brennebene emittierten Photonen wieder auf die ursprüngliche Ebene verteilt. Somit nutzt die Dekonvolution nahezu alle verfügbaren Emissionsintensitäten und sorgt für ein optimales Lichtbudget, was diese Technik zur Methode der Wahl für sehr lichtempfindliche Proben macht.
Eine Variante des Resonanzenergietransferphänomens in der Fluoreszenzmikroskopie, Fluoreszenz oder Förster-Resonanzenergietransfer (FRET), wird genutzt, um quantitative zeitliche und räumliche Informationen über die Bindung und Wechselwirkung von Proteinen, Lipiden, Enzymen und Nukleinsäuren in lebenden Zellen zu erhalten. Bei FRET können entweder Konstantzustands- oder zeitaufgelöste Techniken eingesetzt werden. Die zeitaufgelöste FRET-Bildgebung hat jedoch den Vorteil, dass Donor-Akzeptor-Abstände genauer abgebildet werden können. Für die FRET-Bildgebung kann ein Standard-Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop verwendet werden, das mit geeigneten Anregungs- und Emissionsfiltern und einer empfindlichen Kamera ausgestattet ist. Biosensoren, die ein umweltempfindliches Protein oder Peptid zwischen zwei FRET-anwendbaren fluoreszierenden Proteinen einschließen, werden derzeit häufig in der Zellbiologie eingesetzt. Diese Sonden lassen sich leicht unter Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie mithilfe von FRET-Techniken mit sensibilisierter Emission in Kombination mit ratiometrischer Analyse abbilden. Darüber hinaus können spektrale Bildgebung und lineare Entmischung mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie dabei helfen, FRET-Phänomene in Biosensoren und anderen fluoreszierenden Proteinanwendungen zu überwachen.
Die Fluoreszenzlebensdauer-Bildmikroskopie (FLIM) ist eine hochentwickelte Technik, mit der gleichzeitig die Fluoreszenzlebensdauer und die räumliche Position eines Fluorophors an jeder Stelle im Bild aufgezeichnet werden können. Diese Methode bietet einen Mechanismus zur Untersuchung von Umweltparametern wie pH-Wert, Ionenkonzentration, Lösungsmittelpolarität, nichtkovalenten Wechselwirkungen, Viskosität und Sauerstoffspannung in einzelnen lebenden Zellen und präsentiert die Daten in räumlichen und zeitlichen Arrays. FLIM-Messungen der Lebensdauer angeregter Zustände im Nanosekundenbereich sind unabhängig von lokalen Fluorophorkonzentrationen, Photobleicheffekten und Pfadlänge (Probendicke), reagieren jedoch empfindlich auf Reaktionen angeregter Zustände wie Resonanzenergietransfer. Tatsächlich gilt die Kombination von FLIM mit FRET durch Überwachung der Lebensdaueränderungen fluoreszierender Donatoren vor und nach der Resonanzenergieübertragung als eine der besten Möglichkeiten, dieses Phänomen zu untersuchen.
Die Mobilität (Querdiffusionskoeffizient) von fluoreszenzmarkierten Makromolekülen und kleinen Fluorophoren kann durch die Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleaching (FRAP)-Technik bestimmt werden. Bei FRAP wird ein sehr kleiner ausgewählter Bereich (einige Mikrometer Durchmesser) intensiv beleuchtet, normalerweise mit einem Laser, um eine vollständige Photobleichung des Fluorophors in diesem Bereich zu bewirken. Das Ergebnis ist eine dramatische Verringerung oder Vernichtung der Fluoreszenz. Nach einem Photobleichimpuls wurden Geschwindigkeit und Ausmaß der Wiederherstellung der Fluoreszenzintensität in gebleichten Regionen als Funktion der Zeit bei niedrigen Anregungsintensitäten überwacht, um Informationen über die Kinetik der Wiederbesiedelung und Wiederherstellung der Fluorophore zu erhalten (Abbildung 9). FRAP wird normalerweise mit EGFP oder anderen fluoreszierenden Proteinen durchgeführt. Verwandte Photoaktivierungstechniken basieren auf speziellen synthetischen Käfig-Fluorophoren oder ähnlich funktionellen fluoreszierenden Proteinen, die durch kurze UV- oder Violettimpulse aktiviert werden können. Photoaktivierung und FRAP können als ergänzende Techniken zur Bestimmung von Mobilitätsparametern eingesetzt werden.
Bei einer mit FRAP verwandten Technik, die als Fluoreszenzverlust nach Photobleichung (FLIP) bezeichnet wird, wird ein definierter fluoreszierender Bereich innerhalb einer lebenden Zelle durch intensive Bestrahlung wiederholt photobleichet. Wenn alle Fluorophore während des gemessenen Zeitraums in den Bereich diffundieren könnten, der photogebleicht werden soll, würde dies zu einem vollständigen Verlust des Fluoreszenzsignals in der gesamten Zelle führen. Durch die Berechnung der Geschwindigkeit, mit der die Fluoreszenz in der gesamten Zelle verschwindet, kann die Diffusionsmobilität des Ziel-Fluorophors bestimmt werden. Darüber hinaus kann FLIP leicht den Ort und die Art von Diffusionsbarrieren zwischen einzelnen Zellkompartimenten identifizieren, beispielsweise die Barriere zwischen Soma und Axon eines Neurons.
Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), die hauptsächlich in der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie oder Multiphotonenmikroskopie eingesetzt wird, ist eine Methode zur Bestimmung kinetischer Informationen wie chemische Reaktionsraten, Diffusionskoeffizienten, Techniken für Molekulargewicht, Flussrate und Aggregation. Beim FCS wird ein kleines Volumen (ungefähr ein Femtometer; der beugungsbegrenzte Fokus des Lasers) mit einem fokussierten Laserstrahl beleuchtet, um Autofluoreszenzintensitätsschwankungen aufzuzeichnen, die durch die Dynamik fluoreszierender Moleküle als Funktion der Zeit in dem von Fluoreszenzmittel eingenommenen Volumen verursacht werden Moleküle (Abb. 10). Relativ kleine Fluorophore diffundieren schnell im beleuchteten Volumen und erzeugen kurze Ausbrüche zufälliger Intensität. Umgekehrt bewegen sich größere Komplexe (an Makromoleküle gebundene Fluorophore) langsamer und erzeugen längere, anhaltendere zeitabhängige Fluoreszenzintensitätsmuster.
Wenn fluoreszierend markierte Strukturen dicht gepackt sind und sich in bestimmten Regionen lebender Zellen überlappen, ist ihre Dynamik und räumliche Verteilung schwierig zu analysieren. Die Fluoreszenz-Spot-Mikroskopie (FSM) ist eine Technik, die mit nahezu allen Bildgebungsmodalitäten kompatibel ist und sich sehr geringe Konzentrationen fluoreszierend markierter Untereinheiten zunutze macht, unscharfe Fluoreszenz reduziert und die Sichtbarkeit markierter Strukturen und ihrer Dynamik in dicken Regionen verbessert. FSMs werden implementiert, indem nur ein Bruchteil der gesamten interessierenden Struktur markiert wird. In diesem Sinne ähnelt FSM der Durchführung von FCS über das gesamte Sichtfeld, legt jedoch mehr Wert auf räumliche Muster als auf quantitative Zeitanalysen. Die Fluoreszenzpunktmikroskopie ist besonders nützlich bei der Bestimmung der Mobilität und Aggregation von Zytoskelettelementen wie Aktin und Mikrotubuli in hyperaktiven Zellen.
Stimulated Emission Depletion Microscopy (STED) ist eine aufkommende Superauflösungstechnik mit einer räumlichen Auflösung weit über der Beugungsgrenze, bei der ringförmiges abgereichertes Licht verwendet wird, um einen kleineren Anregungslichtstrahl zu umgeben, um sub-50 nm auf der Achse zu erhalten die Auflösung. Die Technik basiert auf der Anregung von Fluorophoren mit synchronisierten Laserpulsen und räumlich koordinierten kreisförmigen STED-Pulsen, die das emittierte Licht schwächen und die Fluoreszenz angeregter Moleküle rund um den Laserscanfokus unterdrücken. Am Rand des Spots erzeugte Fluoreszenz wird unterdrückt, nicht jedoch in der Mitte des Spots, wodurch sich die Größe des Fluoreszenzspots deutlich verringert und die Auflösung dementsprechend deutlich erhöht. STED hat sich als nützliches Werkzeug für die hochauflösende Erkennung lebender Zellen erwiesen. Andere aufkommende hochauflösende Techniken wie die photoaktivierte Lokalisierungsmikroskopie (PALM) und die strukturierte Lichtbeleuchtungsmikroskopie (SIM) werden in naher Zukunft ebenfalls grundlegende Werkzeuge für die Bildgebung lebender Zellen sein.
Der zunehmende Einsatz genetisch kodierter fluoreszierender Proteine und fortschrittlicher synthetischer Fluorophore für die Bildgebung lebender Zellen öffnet die Tür zu neuen optischen Modalitäten zur Überwachung zeitlicher Dynamik und räumlicher Beziehungen. Mikroskopiker verfügen nun über einen vollständigen Satz an Werkzeugen, um Bilddaten von zellulären Prozessen zu beobachten und aufzuzeichnen, die über einen weiten Zeitbereich und mit mehreren Auflösungen ablaufen. Langsamere Ereignisse können mithilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie leicht beobachtet und aufgezeichnet werden, während schnellere kinetische Ereignisse mithilfe der Spinning-Disk-Technologie erzielt werden können. Darüber hinaus ermöglicht die Multiphotonenmikroskopie eine tiefe Bildgebung in dickem Gewebe, und Totalreflexionstechniken ermöglichen die Untersuchung von Membranoberflächen mit konfokaler Präzision. Fortschrittliche Fluoreszenzmethoden wie FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM und STED können zur Überwachung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Auflösungen verwendet werden, die oft besser sind als die durch die Beugungsgrenze zulässigen. Mit Fortschritten in der Fluorophor-, Mikroskop- und Detektortechnologie wird eine größere Welt „unter die Lupe genommen“.
