Kostengünstiges Fluoreszenz- und Hellfeldmikroskop-Design
Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine Methode zur Visualisierung von
In diesem Handbuch werde ich die Grundlagen der Fluoreszenzmikroskopie erläutern und zeigen, wie man drei verschiedene kostengünstige Fluoreszenzmikroskope baut. Diese Systeme kosten normalerweise Tausende von Dollar, aber es gab in letzter Zeit einige Bemühungen, sie erschwinglicher zu machen. Die hier vorgestellten Designs verwenden ein Smartphone, eine digitale Spiegelreflexkamera und ein USB-Mikroskop. Alle diese Designs können auch als Hellfeldmikroskope verwendet werden.
Schritt 1: Überblick über die Fluoreszenzmikroskopie
Um die Grundkonzepte der Fluoreszenzmikroskopie zu verstehen, stellen Sie sich nachts einen dichten Wald mit Bäumen, Tieren, Büschen und anderen lebenden Bäumen vor. Wenn Sie mit einer Taschenlampe in den Wald leuchten, werden Sie all diese Strukturen sehen, aber es fällt Ihnen schwer, bestimmte Tiere oder Pflanzen zu visualisieren. Angenommen, Sie möchten nur Blaubeersträucher im Wald sehen. Dazu trainieren Sie das Glühwürmchen darauf, nur von Blaubeersträuchern angezogen zu werden, sodass beim Betrachten des Waldes nur die Blaubeersträucher aufleuchten. Man könnte sagen, Sie verwenden Glühwürmchen, um Blaubeersträucher zu markieren, damit Sie Blaubeerstrukturen im Wald sehen können.
In dieser Analogie stellt der Wald die gesamte Probe dar, die Blaubeersträucher die Strukturen, die Sie visualisieren möchten (z. B. bestimmte Zellen oder subzelluläre Organellen) und die Glühwürmchen fluoreszierende Verbindungen. Das Leuchten der Taschenlampe allein ohne die Glühwürmchen ähnelt der Hellfeldmikroskopie.
Der nächste Schritt besteht darin, die grundlegende Funktion fluoreszierender Verbindungen (auch Fluorophore genannt) zu verstehen. Fluorophore sind eigentlich kleine Objekte (im Nanomaßstab), die dazu bestimmt sind, bestimmte Strukturen in einer Probe zu verbinden. Sie absorbieren einen schmalen Wellenlängenbereich des Lichts und emittieren eine andere Wellenlänge des Lichts wieder. Beispielsweise kann ein Fluorophor blaues Licht absorbieren (d. h. der Fluorophor wird durch blaues Licht angeregt) und dann grünes Licht wieder emittieren. Dies wird normalerweise durch die Anregungs- und Emissionsspektren (oben) zusammengefasst. Diese Diagramme zeigen die Wellenlänge des vom Fluorophor absorbierten Lichts und die Wellenlänge des vom Fluorophor emittierten Lichts.
Der Aufbau des Mikroskops ist dem eines normalen Hellfeldmikroskops sehr ähnlich, weist jedoch zwei Hauptunterschiede auf. Erstens muss das Licht, das die Probe beleuchtet, die Wellenlänge haben, die den Fluorophor anregt (im obigen Beispiel ist das Licht blau). Zweitens muss das Mikroskop nur das emittierte Licht (grünes Licht) sammeln und das blaue Licht blockieren. Denn blaues Licht ist überall vorhanden, grünes Licht stammt jedoch nur von bestimmten Strukturen in der Probe. Um blaues Licht zu blockieren, verfügen Mikroskope normalerweise über einen sogenannten Langpassfilter, der grünes Licht ohne blaues Licht durchlässt. Jeder Langpassfilter hat eine Grenzwellenlänge. Wenn das Licht eine längere Wellenlänge als die Grenzwellenlänge hat, kann es den Filter passieren. Daher der Name „Langpass“. Kürzere Wellenlängen werden blockiert.
Schritt 2: Modellieren des Mikroskops mit optischer Optik
Dies ist ein zusätzlicher Schritt zu den Grundprinzipien des Mikroskopdesigns. Es ist nicht erforderlich, ein Fluoreszenzmikroskop zu bauen. Sie können diesen Schritt also überspringen, wenn Sie sich nicht mit der Optik befassen möchten.
Sowohl Hellfeld- als auch Fluoreszenzmikroskope können mithilfe der Strahlenoptik modelliert werden. Die Grundannahme der Strahlenoptik besteht darin, dass sich Licht ähnlich verhält wie Licht, das sich von einer Lichtquelle wegbewegt. Wenn Sie sich in einem Raum umsehen, sehen Sie Licht vom Sonnenlicht vor einem Fenster oder von einer Glühbirne. Das Licht wird dann von Objekten im Raum absorbiert oder reflektiert. Ein Teil des reflektierten Lichts führt dazu, dass es auf Ihre Augen gerichtet wird. Wenn das Objekt beleuchtet ist, können Sie sich vorstellen, dass jeder Punkt auf dem Objekt Licht in alle Richtungen aussendet (oben). Die Linse fokussiert, wie die Linse in unseren Augen, das Licht auf einen Punkt, sodass wir das Objekt sehen können. Ohne Linse bewegt sich das Licht weiter nach außen und bildet kein Bild.
Wie also stellen wir optische Systeme her, die kleine Objekte vergrößern? Um das Design zu verstehen, müssen Sie eigentlich nur zwei Gleichungen kennen: die Abbildungsgleichungen für dünne Linsen und die Vergrößerungsgleichungen:
1/f=1/si + 1/so
M=-si/so
f ist die Brennweite des Objektivs. Eine kürzere Brennweite bedeutet, dass das Objektiv eine höhere Fokussierleistung hat.
Dasselbe gilt für die Objektentfernung, also die Entfernung zwischen der Linse und dem Objekt (z. B. einem Baum).
si ist die Bildweite; der Abstand zwischen der Linse und dem Ort, an dem das Bild entsteht
M ist die Vergrößerung; wie groß das Bild im Verhältnis zum Objekt ist. Bei Mikroskopen wollen wir die Vergrößerung erhöhen.
Ein vollständiges Tutorial zur Gleichung dünner Linsen finden Sie in diesem Khan Academia-Video. Im obigen GIF können Sie sehen, dass die Bildentfernung zunimmt, je näher das Objekt an die Linse heranrückt, was wiederum die Vergrößerung erhöht. Die vertikale Linie mit zwei Pfeilen zeigt die Linse an.
