Wie lässt sich die Morphologie mikrobieller Zellen unter dem Mikroskop beobachten?
Mikroskope wurden erfunden, um lächelnde Objekte zu sehen, die mit bloßem Auge nicht sichtbar sind. Mikroorganismen sind sehr klein, daher müssen sie vergrößert und mit Hilfe eines Mikroskops beobachtet werden. Darüber hinaus gibt es viele Arten von Mikroorganismen, sodass grundsätzlich die meisten optischen Mikroskope Mikroorganismen beobachten können. Die nächste Frage ist, welcher Mikroskoptyp zur Beobachtung und Analyse welcher Mikroorganismen verwendet werden sollte. Zu den gängigen Mikroskopen, die zur Beobachtung der mikrobiellen Morphologie verwendet werden können, gehören biologische Mikroskope, Phasenkontrastmikroskope, inverse Mikroskope, Fluoreszenzmikroskope, konfokale Mikroskope usw.
Im Folgenden werden die verschiedenen Mikroskope beschrieben, die zur Beobachtung von Mikroorganismen verwendet werden:
1. Ein gewöhnliches optisches Mikroskop verwendet natürliches Licht oder Licht als Lichtquelle und seine Wellenlänge beträgt etwa 0,4 μm. Die Auflösung des Mikroskops beträgt die Hälfte der Wellenlänge, also 0,2 μm, und das kleinste mit bloßem Auge sichtbare Bild beträgt 0,2 mm. Daher kann die Verwendung eines Ölspiegels (Immersionsspiegels) zur 1000-fachen Vergrößerung die 0,2 μm großen Partikel auf 0,2 mm vergrößern, die mit bloßem Auge sichtbar sind. Für die Beobachtung von Bakterien, Actinomyceten und Pilzen können gewöhnliche optische Mikroskope verwendet werden.
2. Die Dunkelfeldmikroskopie wird üblicherweise zur Beobachtung der ungefärbten mikrobiellen Morphologie und Bewegung eingesetzt. Nachdem der Dunkelfeldkondensor in ein normales Mikroskop eingebaut wurde, kann das Licht nicht direkt aus der Mitte eindringen und das Sichtfeld ist dunkel. Wenn die Probe schräges Licht vom Rand des Kondensors erhält, kann es gestreut werden, sodass helle Mikroorganismen wie Bakterien oder Spirochäten im dunklen Feldhintergrund beobachtet werden können.
3. Phasenkontrastmikroskop Das Phasenkontrastmikroskop nutzt den Lichteffekt der Phasendifferenzplatte, um die Lichtphase und -amplitude des direkten Lichts zu ändern und die Differenz der Lichtphase in eine Lichtintensitätsdifferenz umzuwandeln. Wenn unter einem Phasenkontrastmikroskop Licht durch eine ungefärbte Probe fällt, wird der Unterschied in der Lichtphase durch die Inkonsistenz der Dichte verschiedener Teile der Probe verursacht, und es können die Morphologie, die innere Struktur und die Bewegungsart von Mikroorganismen beobachtet werden.
4. Fluoreszenzmikroskop Das Fluoreszenzmikroskop ist im Grunde dasselbe wie ein gewöhnliches optisches Mikroskop. Der Hauptunterschied besteht in der Lichtquelle, dem Filter und dem Kondensor. Derzeit verwenden die meisten von ihnen Epi-Light-Geräte, und als Lichtquellen werden üblicherweise Quecksilberhochdrucklampen verwendet, die ultraviolettes oder blauviolettes Licht emittieren können. Es gibt zwei Arten von Filtern: Anregungsfilter und Absorptionsfilter. Neben allgemeinen Hellfeldkondensoren können in Fluoreszenzmikroskopen auch Dunkelfeldkondensoren eingesetzt werden, die blaues Licht nutzen, um den Kontrast zwischen Fluoreszenz und Hintergrund zu verstärken. Diese Methode eignet sich zum Nachweis oder zur Identifizierung von Bakterien, die mit fluoreszierenden Pigmenten gefärbt oder mit fluoreszierenden Antikörpern kombiniert sind.
5. Elektronenmikroskope nutzen den Elektronenfluss als Lichtquelle, und die Wellenlänge unterscheidet sich zehntausende Male vom sichtbaren Licht, was die Auflösung erheblich verbessert. Außerdem wird eine Magnetspule als optisches Verstärkungssystem verwendet, und die Vergrößerung kann das Zehntausende oder Hunderttausendfache erreichen. Es wird häufig zur Beobachtung von Viruspartikeln und der bakteriellen Ultrastruktur verwendet.
Beobachtung ungefärbter mikrobieller Proben:
Ungefärbte Proben können im Allgemeinen zur Beobachtung der Morphologie, Kraft und Bewegung von Bakterien verwendet werden. Bakterien sind im ungefärbten Zustand farblos und transparent und werden unter dem Mikroskop hauptsächlich anhand des Unterschieds zwischen dem Brechungsindex der Bakterien und der Umgebung beobachtet. Bakterien mit Flagellen bewegen sich kräftig, während Bakterien ohne Flagellen eine unregelmäßige Brownsche Bewegung zeigen. Lebensfähige Bakterien wie Treponema pallidum, Leptospira und Campylobacter weisen charakteristische Formen und Bewegungsmuster auf, die von diagnostischer Bedeutung sind. Häufig verwendete Methoden sind die Druckabfallmethode, die Pendant-Drop-Methode und die Kapillarmethode.
1. Tragen Sie Vaseline rund um das konkave Loch des sauberen Konkavglases mit der Methode des hängenden Tropfens auf, nehmen Sie mit einer Impföse einen Ring aus Bakteriensuspension und platzieren Sie ihn in der Mitte des Deckglases. Richten Sie dann das konkave Loch des Konkavglases darauf aus Geben Sie den Tropfen in die Mitte des Deckglases und decken Sie es ab, drehen Sie es dann schnell um, drücken Sie leicht auf das Deckglas, damit es fest an der Vaseline am Rand des konkaven Lochs haftet, und beobachten Sie es unter einem Mikroskop mit starker Vergrößerung (oder). dunkles Feld).
2. Nehmen Sie einen Ring aus Bakteriensuspension mit einer Impföse und platzieren Sie ihn mithilfe der Druckabfallmethode in der Mitte eines sauberen Glasobjektträgers. Decken Sie die Bakteriensuspension vorsichtig mit einem Deckglas ab und achten Sie darauf, Blasen und ein Überlaufen der Bakteriensuspension zu vermeiden . Nachdem Sie einige Sekunden still gestanden haben, beobachten Sie es unter einem Hochleistungsmikroskop im Hellfeld (oder Dunkelfeld).
3. Die Kapillarmethode wird hauptsächlich zur Untersuchung der Kinetik anaerober Bakterien eingesetzt. Wählen Sie normalerweise eine Länge von 60~70mm. Nachdem Sie die anaerobe Bakteriensuspension durch eine Kapillare mit einer Öffnung von 0,5-1,0 mm abgesaugt haben, verschließen Sie die beiden Enden der Kapillare mit einer Flamme. Die Kapillare wurde mit Plastikpapier auf dem Objektträger fixiert und unter einer Hochleistungslinse im Dunkelfeld beobachtet.
Beobachtung gefärbter mikrobieller Proben mit einem Mikroskop:
Nachdem die Bakterienprobe gefärbt wurde, werden aufgrund des starken Farbkontrasts zwischen den Bakterien und der Umgebung die morphologischen Eigenschaften der Bakterien (wie Größe, Form, Anordnung usw.) der Bakterien und einige spezielle Strukturen (z. B B. Kapseln, Flagellen, Sporen usw.) können unter einem gewöhnlichen optischen Mikroskop deutlich beobachtet werden, und die Bakterien können anhand der Färbereaktivität klassifiziert und identifiziert werden.
(1) Allgemeine Vorgehensweise bei der Bakterienfärbung Die allgemeine Vorgehensweise bei der Bakterienfärbung ist: Abstrich (Trocknung) – Fixierung – Färbung.
1. Abstrichvorbereitung von Blut, Sekreten, Ausscheidungen, Punktionsflüssigkeit und Flüssigkultur sowie direkte Dünnschichtausstriche auf Glasobjektträgern; Bei einer Autopsie oder bei infiziertem Tiergewebe wischen Sie die Läsion zur Probenahme mit einem Wattestäbchen ab. Für die Vorbereitung von Bakterienkolonien oder Rasen auf festem Medium verwenden Sie zunächst eine Impföse, um einen Ring normaler Kochsalzlösung zu entnehmen und ihn in die Mitte des Glasobjektträgers zu legen. Anschließend verwenden Sie eine sterile Impföse, um eine kleine Menge Kultur zu entnehmen und zu vermahlen Geben Sie es gleichmäßig in normale Kochsalzlösung, verteilen Sie es auf einer beschichteten Oberfläche von 1 cm² und lassen Sie es auf natürliche Weise bei Raumtemperatur trocknen oder langsam aus der Ferne trocknen.
2. Der Zweck der Fixierung besteht darin, Bakterien abzutöten, Bakterienprotein und -struktur zu koagulieren und die Färbung zu erleichtern. Fördern Sie die Anhaftung von Bakterien am Objektträger, um zu verhindern, dass sie beim Waschen durch Wasser weggespült werden. verändern die Permeabilität von Bakterien für Farbstoffe, was sich positiv auf die Färbung bakterieller intrazellulärer Strukturen auswirkt. Die Fixierung erfolgt üblicherweise durch Erhitzen mit einer Flamme und der getrocknete Ausstrich wird dreimal schnell durch die Flamme geführt. Es ist besser, die Haut am Handrücken nicht zu verbrennen, wenn er den Schlitten berührt.
3. Färben Wählen Sie je nach Inspektionszweck unterschiedliche Färbemethoden zum Färben. Geben Sie beim Färben die Farbstofflösung tropfenweise hinzu, um die Deckkraft zu erhöhen.
4. Beizmittel Jede Substanz, die die Affinität zwischen dem Farbstoff und dem gefärbten Objekt verstärken, den Farbstoff auf dem gefärbten Objekt fixieren und eine Änderung der Durchlässigkeit der Zellmembran bewirken kann, wird Beizmittel genannt. Üblicherweise werden Alaun, Gerbsäure, Metallsalze und Jod usw. verwendet, und auch Erhitzen wird zur Förderung der Färbung eingesetzt. Beizmittel können zwischen Primärfärbung und Gegenfärbung verwendet werden, können aber auch nach der Fixierung verwendet werden oder in Fixiermittel und Färbung enthalten sein.
5. Entfärbung Jedes chemische Mittel, das die Farbe des gefärbten Objekts entfernen kann, wird als Entfärbungsmittel bezeichnet. Als Entfärber werden üblicherweise Ethanol, Aceton usw. verwendet. Das Entfärbungsmittel kann den Grad der Stabilität der Kombination aus Bakterien und Farbstoffen erkennen, die für die Differenzfärbung verwendet werden kann.
6. Gegenfärben Entfärbte Bakterien oder deren Strukturen werden häufig zur leichteren Beobachtung mit einer Gegenfärbelösung gegengefärbt. Die Farbe der Gegenfärbelösung unterscheidet sich von der der Primärfärbelösung, um einen scharfen Kontrast zu erzeugen. Die Gegenfärbung sollte nicht zu stark sein, um die Farbe der ursprünglichen Färbung nicht zu verdecken.
