Unterschiede und Eigenschaften zwischen Fluoreszenzmikroskop und gewöhnlichem optischen Mikroskop
Ein Fluoreszenzmikroskop unterscheidet sich von einem gewöhnlichen optischen Mikroskop. Es beobachtet die Probe nicht durch die Beleuchtung einer gewöhnlichen Lichtquelle. Stattdessen wird Licht einer bestimmten Wellenlänge (normalerweise ultraviolettes Licht, blau-violettes Licht) verwendet, um das fluoreszierende Material in der Probe unter dem Mikroskop anzuregen, wodurch es Fluoreszenz emittiert. Daher dient die Lichtquelle eines Fluoreszenzmikroskops nicht als direkte Beleuchtung, sondern als Energiequelle, die das interne fluoreszierende Material der Probe anregt. Der Grund, warum wir die Probe beobachten können, liegt nicht an der Beleuchtung der Lichtquelle, sondern am Fluoreszenzphänomen, das dadurch verursacht wird, dass das fluoreszierende Material in der Probe die angeregte Lichtenergie absorbiert. Es ist ersichtlich, dass das Hauptmerkmal eines Fluoreszenzmikroskops darin besteht, dass seine Lichtquelle eine große Menge an Anregungslicht in einem bestimmten Wellenlängenbereich liefern kann, sodass die fluoreszierenden Substanzen in der untersuchten Probe die erforderliche Intensität an Anregungslicht erhalten können. Gleichzeitig müssen Fluoreszenzmikroskope über entsprechende Filtersysteme verfügen. Die Fluoreszenzmikroskopie ist ein wesentliches Werkzeug für die fortgeschrittene Fluoreszenzhistochemie. Es besteht aus einer Ultrahochdrucklichtquelle, einem Filtersystem (einschließlich Anregungs- und Unterdrückungsfilterplatten), einem optischen System und einem Fotografiesystem. Es verwendet Licht einer bestimmten Wellenlänge, um die Probe zur Fluoreszenz anzuregen.
1. Möglichkeiten zur Anregung der Fluoreszenz: Je nach Wellenlängenbereich des Lichts wird es in zwei Typen unterteilt: UV-Anregungsmethode (unter Verwendung einer ultravioletten Beleuchtungsmethode) und BV-Anregungsmethode (unter Verwendung eines blau-violetten Lichts). Die UV-Anregungsmethode verwendet zur Anregung nahes ultraviolettes Licht kürzer als 400 nm. Bei dieser Methode gibt es kein sichtbares Anregungslicht, sodass die beobachtete Fluoreszenz die inhärente Fluoreszenz des Farbstoffs zeigt, wodurch es leicht ist, die spezifische Fluoreszenz auf der Probe von der Autofluoreszenz des Hintergrundgewebes zu unterscheiden.
2. BV-Anregungsmethode: Anregung von ultraviolettem zu blauem Licht mit Schwerpunkt bei 404 nm und 434 nm. Bei dieser Methode wird blaues Licht zur Beleuchtung der Probe verwendet, daher muss der Sperrfilter des Fluoreszenzbeobachtungssystems ein Filter sein, der blaues Licht vollständig blockieren und die erforderliche grüne und gelbe Fluoreszenz vollständig durchlassen kann. Fluoreszenzfarbstoffe, die in Fluoreszenzantikörpermethoden verwendet werden. Die maximale Absorptionswellenlänge des Anregungslichts und die maximale Emissionswellenlänge der Fluoreszenz liegen relativ nahe beieinander, daher muss der bei der BV-Anregungsmethode verwendete Filter ein scharfer Sperrfilter sein. Bei dieser Methode kann blaues Licht als Anregungslicht verwendet werden, sodass die Absorptionseffizienz der fluoreszierenden Pigmente höher ist und hellere Bilder erzielt werden können. Der Nachteil besteht darin, dass Fluoreszenz unter 500 nm nicht sichtbar ist, während Fluoreszenz über 500 nm das gesamte Bild gelb erscheinen lässt. Bei der Fluoreszenzantikörpermethode wird die Spezifität des Fluoreszenzfarbstoffs hauptsächlich anhand seiner einzigartigen Farbe beurteilt. Wenn daher die subtile Spezifität diskutiert wird, haben die oben genannten Mängel der BV-Anregungsmethode häufig einen großen Einfluss.
