Unterschiede und Eigenschaften zwischen Fluoreszenzmikroskopen und gewöhnlichen optischen Mikroskopen
Das Fluoreszenzmikroskop unterscheidet sich vom gewöhnlichen optischen Mikroskop dadurch, dass es keine Proben unter der Beleuchtung gewöhnlicher Lichtquellen beobachtet. Stattdessen wird Licht einer bestimmten Wellenlänge (normalerweise ultraviolettes Licht, blauviolettes Licht) verwendet, um die fluoreszierenden Substanzen in der Probe unter dem Mikroskop anzuregen, sodass sie Fluoreszenz abgeben. Daher besteht die Rolle der Lichtquelle im Fluoreszenzmikroskop nicht in der direkten Beleuchtung, sondern als Energiequelle zur Anregung der fluoreszierenden Substanzen im Inneren der Probe. Der Grund, warum wir Proben beobachten können, liegt nicht in der Beleuchtung der Lichtquelle, sondern im Fluoreszenzphänomen, das die fluoreszierenden Substanzen im Inneren der Probe zeigen, nachdem sie die angeregte Lichtenergie absorbiert haben. Daraus lässt sich erkennen, dass die Besonderheit der Fluoreszenzmikroskopie vor allem darin besteht, dass ihre Lichtquelle eine große Menge Anregungslicht in einem bestimmten Wellenlängenbereich liefern kann, sodass die fluoreszierenden Substanzen in der Probe die erforderliche Intensität des Anregungslichts erhalten können. Gleichzeitig müssen Fluoreszenzmikroskope über entsprechende Filtersysteme verfügen. Das Fluoreszenzmikroskop ist ein grundlegendes Werkzeug in der Fluoreszenzgewebechemie. Es besteht aus Hauptkomponenten wie einer Ultrahochspannungslichtquelle, einem Filtersystem (einschließlich Anregungs- und Unterdrückungsfilterplatten), einem optischen System und einem Fotosystem. Es nutzt Licht einer bestimmten Wellenlänge, um die Probe anzuregen und Fluoreszenz auszusenden.
1. Methoden der Fluoreszenzanregung: Je nach Wellenlängenbereich des Lichts gibt es zwei Arten: UV-Anregungsmethode (unter Verwendung von ultravioletter Beleuchtung) und BV-Anregungsmethode (unter Verwendung von blauviolettem Licht). Bei der UV-Anregungsmethode wird zur Anregung nahezu ultraviolettes Licht mit einer Wellenlänge von weniger als 400 nm verwendet. Bei dieser Methode ist kein sichtbares Anregungslicht vorhanden, sodass die beobachtete Fluoreszenz die inhärente Fluoreszenz des Farbstoffs aufweist, sodass die spezifische Fluoreszenz auf der Probe leicht von der Eigenfluoreszenz des Hintergrundgewebes unterschieden werden kann.
2. BV-Anregungsmethode: Dabei handelt es sich um eine Anregung von ultraviolettem zu blauem Licht mit den Schwerpunkten 404 nm und 434 nm. Bei dieser Methode wird blaues Licht zur Bestrahlung der Probe verwendet. Daher muss der Sperrfilter des Fluoreszenzbeobachtungssystems einen Filter verwenden, der blaues Licht vollständig blockieren und die erforderliche grüne und gelbe Fluoreszenz vollständig durchlassen kann. Fluoreszierende Pigmente für die Fluoreszenz-Antikörper-Methode. Die maximale Absorptionswellenlänge des Anregungslichts und die maximale Emissionswellenlänge der Fluoreszenz liegen relativ nahe beieinander, daher muss der bei der BV-Anregungsmethode verwendete Filter einen scharfen Schnittfilter verwenden. Bei dieser Methode kann blaues Licht als Anregungslicht verwendet werden, sodass die Absorptionseffizienz fluoreszierender Pigmente hoch ist und hellere Bilder erhalten werden können. Der Nachteil besteht darin, dass Fluoreszenz unter 500 nm nicht sichtbar ist, während Fluoreszenz über 500 nm das gesamte Bild gelb erscheinen lässt. Bei der fluoreszierenden Antikörpermethode wird die Spezifität hauptsächlich durch die Farbe bestimmt, die fluoreszierenden Pigmenten eigen ist. Wenn es also um subtile Spezifität geht, haben die oben erwähnten Nachteile der BV-Anregungsmethode oft einen erheblichen Einfluss.
