Unterschied zwischen Fluoreszenzmikroskop und Normalmikroskop
1. Sehen Sie sich die Beleuchtungsmethode an
Das Beleuchtungsverfahren des Fluoreszenzmikroskops ist im Allgemeinen vom Epi-Typ, das heißt, die Lichtquelle wird durch die Objektivlinse auf die Testprobe platziert.
2. Sehen Sie sich die Auflösung an
Fluoreszenzmikroskope verwenden als Lichtquelle ultraviolettes Licht mit einer relativ kurzen Wellenlänge, aber die Auflösung ist höher als die gewöhnlicher optischer Mikroskope.
3, der Unterschied im Filter
Das Fluoreszenzmikroskop verwendet zwei spezielle Filter, die vor der Lichtquelle verwendet werden, um sichtbares Licht herauszufiltern, und zwischen der Objektivlinse und dem Okular verwendet werden, um ultraviolettes Licht herauszufiltern, das das menschliche Auge schützen kann.
Das Fluoreszenzmikroskop ist auch eine Art optisches Mikroskop, hauptsächlich weil die durch das Fluoreszenzmikroskop angeregte Wellenlänge kurz ist, was zu einem Unterschied in der Struktur und Verwendung des Fluoreszenzmikroskops und des gewöhnlichen Mikroskops führt. Die meisten Fluoreszenzmikroskope haben eine gute Funktion, schwaches Licht einzufangen. , so dass auch bei extrem schwacher Fluoreszenz die Abbildungsfähigkeit gut ist. Gekoppelt mit der kontinuierlichen Verbesserung der Fluoreszenzmikroskopie in den letzten Jahren wurde auch das Rauschen stark reduziert. Daher kommen immer mehr Fluoreszenzmikroskope zum Einsatz.
Kenntnisse in der Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie
Das Grundprinzip der Zwei-Photonen-Anregung ist: Bei hoher Photonendichte können fluoreszierende Moleküle zwei langwellige Photonen gleichzeitig absorbieren und nach einer sehr kurzen sogenannten Lebensdauer des angeregten Zustands ein kurzwelliges Photon emittieren ; Der Effekt ist der gleiche wie bei der Anregung eines fluoreszierenden Moleküls durch ein Photon mit einer halben Wellenlänge. Die Zwei-Photonen-Anregung erfordert eine hohe Photonendichte, und um Zellen nicht zu beschädigen, verwendet die Zwei-Photonen-Mikroskopie hochenergetische modengekoppelte gepulste Laser. Dieser Laser emittiert Laserlicht mit hoher Spitzenenergie und niedriger Durchschnittsenergie, mit einer Pulsbreite von nur 100 Femtosekunden und einer Frequenz von 80 bis 100 MHz. Wenn eine Objektivlinse mit hoher numerischer Apertur verwendet wird, um die Photonen des gepulsten Lasers zu fokussieren, ist die Photonendichte im Brennpunkt der Objektivlinse am höchsten, und die Zwei-Photonen-Anregung tritt nur im Brennpunkt der Objektivlinse auf. Daher benötigt das Zwei-Photonen-Mikroskop keine konfokale Lochblende, was die Fluoreszenzdetektionseffizienz verbessert.
Beim allgemeinen Fluoreszenzphänomen kann ein fluoreszierendes Molekül aufgrund der geringen Photonendichte des Anregungslichts nur ein Photon gleichzeitig absorbieren und dann durch den Strahlungsübergang ein fluoreszierendes Photon emittieren, was als Einzelphotonenfluoreszenz bezeichnet wird. Für den Fluoreszenzanregungsprozess mit einem Laser als Lichtquelle kann ein Zwei-Photonen- oder sogar ein Mehr-Photonen-Fluoreszenzphänomen auftreten. Zu diesem Zeitpunkt ist die Intensität der verwendeten Anregungslichtquelle hoch und die Photonendichte erfüllt die Anforderung, dass das fluoreszierende Molekül gleichzeitig zwei Photonen absorbiert. Bei der Verwendung eines allgemeinen Lasers als Anregungslichtquelle reicht die Photonendichte immer noch nicht aus, um eine Zwei-Photonen-Absorption zu erzeugen. Üblicherweise wird ein gepulster Femtosekundenlaser verwendet, dessen Momentanleistung die Größenordnung von Megawatt erreichen kann. Daher ist die Wellenlänge der Zwei-Photonen-Fluoreszenz kürzer als die Wellenlänge des Anregungslichts, was äquivalent zu dem Effekt ist, der durch die Anregung mit halber Anregungswellenlänge erzeugt wird.
Die Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie hat viele Vorteile:
1) Langwelliges Licht wird weniger durch Streuung beeinflusst als kurzwelliges Licht und kann die Probe leicht durchdringen;
2) Die fluoreszierenden Moleküle außerhalb der Fokusebene werden nicht angeregt, so dass mehr Anregungslicht die Fokusebene erreichen kann, so dass das Anregungslicht tiefere Proben durchdringen kann;
3) langwelliges nahes Infrarotlicht ist für Zellen weniger toxisch als kurzwelliges Licht;
4) Beim Betrachten von Proben mit Zwei-Photonen-Mikroskopie sind Photobleichung und Phototoxizität nur in der Fokusebene vorhanden. Daher eignet sich die Zwei-Photonen-Mikroskopie besser zum Betrachten dicker Proben als die Ein-Photonen-Mikroskopie, zum Betrachten lebender Zellen oder zum Durchführen von Fixpunkt-Photobleichexperimenten.
Kenntnisse in der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie
Das Grundprinzip der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie: Durch die Beleuchtung der Probe mit einer Punktlichtquelle entsteht in der Fokusebene ein kleiner Lichtpunkt mit scharfer Kontur. bestehend aus dem Strahlteiler. Der Strahlteiler schickt die Fluoreszenz direkt zum Detektor. Vor der Lichtquelle und dem Detektor befindet sich eine Lochblende, die Beleuchtungslochblende bzw. Detektionslochblende genannt wird. Die geometrischen Abmessungen der beiden sind gleich, etwa 100-200 nm; relativ zum Lichtfleck in der Fokusebene sind beide konjugiert, dh der Lichtfleck durchläuft eine Reihe von Linsen und kann schließlich gleichzeitig auf die Beleuchtungslochblende und die Detektionslochblende fokussiert werden. Auf diese Weise kann das Licht aus der Fokusebene im Bereich des Detektionslochs konzentriert werden, während das Streulicht von oberhalb oder unterhalb der Fokusebene aus dem Detektionsloch ausgeblendet wird und nicht abgebildet werden kann. Die Probe wird Punkt für Punkt mit dem Laser abgetastet, und die Photomultiplier-Röhre erhält nach Erkennung der Lochblende ebenfalls Punkt für Punkt das konfokale Bild des entsprechenden Lichts, das in ein digitales Signal umgewandelt und an den Computer übertragen und schließlich weiter aggregiert wird den Bildschirm in ein klares konfokales Bild der gesamten Fokusebene. .
Jedes Fokusebenenbild ist eigentlich ein optischer Querschnitt der Probe, und dieser optische Querschnitt hat immer eine bestimmte Dicke, die auch als optische Schicht bezeichnet wird. Da die Lichtintensität am Brennpunkt viel größer ist als die am Nicht-Brennpunkt und das Licht der Nicht-Brennebene durch die Lochblende herausgefiltert wird, ist die Schärfentiefe des konfokalen Systems ungefähr null und das Abtasten entlang der Die Z-Achse kann eine optische Tomographie realisieren, indem sie einen zweidimensionalen optischen Schnitt am fokussierten Punkt der Probe bildet. Durch Kombinieren des Scannens in der XY-Ebene (Brennebene) mit dem Scannen in der Z-Achse (optische Achse) durch Akkumulieren zweidimensionaler Bilder aufeinanderfolgender Schichten und Verarbeiten durch spezielle Computersoftware kann ein dreidimensionales Bild der Probe erhalten werden.
Das heißt, die Detektionslochblende und die Lichtquellenlochblende werden immer auf denselben Punkt fokussiert, so dass die außerhalb der Fokussierebene angeregte Fluoreszenz nicht in die Detektionslochblende eintreten kann.
Der einfache Ausdruck des Arbeitsprinzips des konfokalen Lasers besteht darin, dass er einen Laser als Lichtquelle verwendet und auf der Grundlage der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop-Bildgebung ein Laserscangerät und ein konjugiertes Fokussiergerät sowie die digitale Bilderfassung und -verarbeitung anbringt System wird von einem Computer gesteuert.
