Konfokale Fluoreszenzmikroskop-Kenntnisse
Das Grundprinzip der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie: Eine Punktlichtquelle bestrahlt die Probe und bildet einen kleinen, gut definierten Lichtpunkt auf der Brennebene. Die von diesem Punkt nach der Bestrahlung emittierte Fluoreszenz wird von der Objektivlinse gesammelt und entlang des ursprünglichen Bestrahlungslichtwegs zum Strahlteiler zurückgeschickt, der aus einem bidirektionalen chromatischen Spiegel besteht. Der Strahlteiler schickt die Fluoreszenz direkt zum Detektor. Sowohl die Lichtquelle als auch der Detektor haben jeweils ein Loch vor sich, das als Beleuchtungsloch bzw. Detektionsloch bezeichnet wird. Beide haben dieselbe Geometrie, etwa 100-200 nm, und sind in Bezug auf den Lichtpunkt auf der Brennebene konjugiert, d. h. der Lichtpunkt durchläuft eine Reihe von Linsen und kann schließlich sowohl auf die Beleuchtungs- als auch auf die Detektorlöcher fokussiert werden. Auf diese Weise kann Licht aus der Brennebene innerhalb der Sondenöffnung konvergieren, während Streulicht von oberhalb oder unterhalb der Brennebene außerhalb der Sondenöffnung blockiert wird und nicht abgebildet werden kann. Der Laser tastet die Probe Punkt für Punkt ab, und der Photovervielfacher erfasst nach dem Erkennen der Lochblende auch Punkt für Punkt das konfokale Bild des entsprechenden Lichtpunkts, das in ein digitales Signal umgewandelt und an den Computer übertragen wird und schließlich auf dem Bildschirm zu einem klaren konfokalen Bild der gesamten Brennebene konvergiert.
Jedes Brennebenenbild ist eigentlich ein optischer Querschnitt der Probe, und dieser optische Querschnitt weist immer eine bestimmte Dicke auf, die auch als optische Schicht bezeichnet wird. Da die Lichtintensität am Brennpunkt viel größer ist als am Nicht-Brennpunkt und das Nicht-Brennebenenlicht durch die Lochblende herausgefiltert wird, nähert sich die Schärfentiefe des konfokalen Systems Null an, und durch Scannen entlang der Z-Achsen-Richtung kann die optische Tomographie eine zweidimensionale optische Scheibe der Probe bilden, die im Brennpunkt beobachtet werden kann. Durch Kombination von Scannen in der XY-Ebene (Brennebene) mit Scannen entlang der Z-Achse (optische Achse) kann ein dreidimensionales Bild der Probe erstellt werden, indem aufeinanderfolgende Schichten zweidimensionaler Bilder angesammelt werden, die durch spezielle Computersoftware verarbeitet werden.
Dies bedeutet, dass das Detektionsloch und das Loch der Lichtquelle immer auf den gleichen Punkt fokussiert sind, sodass außerhalb der Brennebene angeregte Fluoreszenz nicht in das Detektionsloch gelangen kann.
Das Funktionsprinzip der Laser-Konfokalkamera lässt sich einfach so zusammenfassen, dass sie einen Laser als Lichtquelle verwendet und auf der Grundlage herkömmlicher Fluoreszenzmikroskop-Bildgebung, eines zusätzlichen Laser-Scanning-Geräts und eines konjugierten Fokussierungsgeräts computergesteuert ein digitales Bildaufnahme- und -verarbeitungssystem ausführt.
