Vergleich zwischen Konfokalmikroskop und gewöhnlichem optischen Mikroskop
Das Mikroskop ist das wichtigste Werkzeug zur Beobachtung von Zellen. Je nach Lichtquelle kann es in zwei Kategorien unterteilt werden: optisches Mikroskop und Elektronenmikroskop. Ersteres verwendet sichtbares Licht (Ultraviolettmikroskop bis Ultraviolettlicht) als Lichtquelle, während letzteres einen Elektronenstrahl als Lichtquelle verwendet. Gewöhnliches optisches Mikroskop und Laser-Konfokalmikroskop gehören zum selben optischen Mikroskop.
I. Allgemeines optisches Mikroskop
Ein gewöhnliches biologisches Mikroskop besteht aus drei Teilen, nämlich: 1. Beleuchtungssystem mit Lichtquelle und Kondensator; 2. optisches Vergrößerungssystem mit Objektiven und Okularen, das den Hauptteil des Mikroskops bildet. Um sphärische Aberration und chromatische Aberration zu eliminieren, bestehen Okulare und Objektive aus komplexen Linsengruppen; 3. mechanische Vorrichtung zum Fixieren des Materials und für eine bequeme Beobachtung.
Die Klarheit eines Objekts unter einem Mikroskop wird nicht nur durch die Vergrößerung bestimmt, sondern auch durch das Auflösungsvermögen (die Auflösung) des Mikroskops. Das Auflösungsvermögen bezieht sich auf die Fähigkeit des Mikroskops (oder des menschlichen Auges vom Zielobjekt in einem Abstand von 25 cm), Objekte in kleinen Abständen voneinander unterscheiden zu können. Die Größe des Auflösungsvermögens wird durch die Wellenlänge des Lichts, die Spiegelöffnungsrate und den Brechungsindex des Mediums bestimmt und durch die folgende Formel ausgedrückt:
R=0.61λ /NANA=nsin /2 wobei: n=der Brechungsindex des Mediums;=der Spiegelöffnungswinkel (Spannungswinkel der Probe auf der Objektivlinse), NA=Spiegelöffnungsrate (numerische Apertur). Der Winkel der Spiegelöffnung muss immer kleiner als 180° sein, daher ist der zui-Wert von sina/2 notwendigerweise kleiner als 1.
Der Brechungsindex des bei der Herstellung optischer Linsen verwendeten Glases beträgt 1,65 bis 1,78. Je näher der Brechungsindex des verwendeten Mediums am Glas liegt, desto besser. Bei trockenen Objektivlinsen beträgt das Medium Luft und die Spiegelöffnungsrate im Allgemeinen 0.05 bis 0,95; bei Öllinsen mit Zedernöl als Medium kann die Spiegelöffnungsrate nahe bei 1,5 liegen.
Bei normaler Lichtwellenlänge beträgt die Auflösung des Mikroskops 400~700nm, sodass der Auflösungswert des Mikroskops nicht unter 0,2μm liegt. Die Auflösung des menschlichen Auges beträgt 0,2μm, sodass die Vergrößerung bei der Konstruktion eines Mikroskops im Allgemeinen 1000-fach beträgt.
Zweitens, Laser-konfokales Rastermikroskop
Konfokales Laser-Rastermikroskop (konfokales Laser-Rastermikroskop) mit einem Laser als Scan-Lichtquelle, das Punkt für Punkt, Zeile für Zeile, Oberfläche für Oberfläche schnell scannt, Laser-Scanning und Fluoreszenzerfassung mit einem gemeinsamen Objektiv, Fokussierungspunkt des Objektiv-Scanning-Lasers und sofortige Abbildung des Objektpunkts. Aufgrund der kürzeren Wellenlänge des Laserstrahls ist der Strahl sehr fein, sodass das konfokale Laser-Rastermikroskop eine hohe Auflösung hat, die etwa dreimal so hoch ist wie die eines gewöhnlichen optischen Mikroskops. Das System wird einmal fokussiert und der Scan ist auf eine Ebene der Probe beschränkt. Wenn die Fokussierungstiefe nicht gleich ist, können Bilder von unterschiedlichen Tiefenebenen der Probe erhalten werden, und diese Bildinformationen werden im Computer gespeichert, um durch Computeranalyse und -simulation die dreidimensionale Struktur der Zellprobe anzuzeigen.
