Anwendung des modernen Mikroskopkonzepts bei der Beobachtung der mikroskopischen Welt
Von der Antike bis zur Gegenwart streben die Menschen nach höheren und weitergehenden Wahrheiten. Von Ozeanreisen bis zur Erforschung des Weltraums haben Menschen nacheinander große Ziele erreicht. Allerdings ist die makroskopische Welt, die der Mensch mit bloßem Auge sieht, nicht die ganze Welt und das menschliche Auge kann sie nicht klar sehen. Es lockt auch unzählige Menschen zum Erkunden und Verfolgen an.
Unabhängig von makroskopischen oder mikroskopischen Dingen basieren unsere Beobachtungen auf den Attributen des dreidimensionalen Raums, d Die vollständigste Möglichkeit, Dinge zu beobachten, muss die gleichzeitige Aufzeichnung von XYZT sein, also die Langzeitfotografie von Form plus Zeit, ist auch die ultimative Funktion des Mikroskops.
Nach mehr als 300 Jahren Entwicklung haben moderne Mikroskope Konzepte wie Auflösung, Schärfentiefe und Sichtfeld vorgeschlagen und kontinuierlich Lösungen vorgeschlagen. Mikroskope haben zunächst unseren Bedarf zur Beobachtung der mikroskopischen Welt gedeckt und uns dabei geholfen, den Raum und die Zeit der mikroskopischen Welt aufzuzeichnen.
Das Wichtigste bei der mikroskopischen Weltbeobachtung ist die Auflösung von Details, und daraus entstand der Begriff der Auflösung. Die Auflösung bezieht sich auf den minimalen Abstand zwischen zwei Punkten, der vom menschlichen Auge unterschieden werden kann, und gilt nur in der XY-Dimension. Nach dem Rayleigh-Kriterium, Rayleigh-Kriterium, liegt die Grenze, die normale Menschen unterscheiden können, bei zwei Punkten von 0,2 mm in einem Abstand von 25 cm. Wenn wir ein Mikroskop verwenden, können wir zwei Punkte in einem geringeren Abstand sehen, was die Auflösung unserer Beobachtung verbessert. Mit der kontinuierlichen Vertiefung der modernen Forschung steigen auch die Anforderungen der Menschen an die Auflösung ständig und Wissenschaftler verbessern auch ständig die Auflösung von Mikroskopen. Beispielsweise haben Elektronenmikroskope die Auflösung auf den Nanometerbereich erhöht und ermöglichen so die Beobachtung von Viren. Ultrahochmikroskopische Bildgebungstechnologie verbessert die Auflösung des Mikroskops von 200 Nanometern auf mehrere zehn Nanometer und ermöglicht so die Beobachtung lebender Zellorganellen.
Die Verbesserung der Auflösung bringt auch neue Probleme mit sich, nämlich die Reduzierung des Sichtfeldes und der Schärfentiefe. Bei Verwendung der gewöhnlichen zentralen Beleuchtungsmethode (der photopischen Beleuchtungsmethode, bei der das Licht gleichmäßig durch die Probe geht) beträgt der Auflösungsabstand des Mikroskops d=0.61 λ/NA, der Wellenlängenbereich des sichtbaren Lichts beträgt { {2}}nm, die durchschnittliche Wellenlänge beträgt 550 nm und die Wellenlänge ist eine feste Konstante. Daher kann durch Erhöhen des NA-Werts ein kleinerer D-Wert erzielt werden, d. h. der Abstand zwischen zwei Punkten, der unterschieden werden kann. Kleiner, sodass Menschen kleinere Objekte deutlich sehen können.
Der NA-Wert ist die numerische Apertur, die die Größe des Lichtempfangskegelwinkels der Linse beschreibt, NA=n * sin , d. h. das Produkt des Brechungsindex (n) des Mediums zwischen der Linse und das zu untersuchende Objekt und der Sinus der Hälfte des Öffnungswinkels (2 ). n ist der Lichtbrechungsindex des Mediums zwischen der Objektivlinse und der Probe. Wenn das Raummedium des Mikroskopobjekts Luft ist, beträgt der Brechungsindex n=1. Die Verwendung eines Mediums mit einem höheren Brechungsindex als Luft kann den NA-Wert deutlich erhöhen. Das Wasserimmersionsmedium ist destilliertes Wasser und das Verhältnis des Brechungsindex beträgt 1,33; Das Ölimmersionsobjektivmedium ist Zedernöl oder andere transparente Öle, und sein Brechungsindex liegt im Allgemeinen bei etwa 1,52, was nahe am Brechungsindex der Linse und des Objektträgerglases liegt. Daher ist der NA-Wert der Öllinse höher als der der Luftlinse.
Der Öffnungswinkel, auch „Spiegelmündungswinkel“ genannt, ist der Winkel, den der Objektpunkt auf der optischen Achse des Objektivs und der effektive Durchmesser der Frontlinse des Objektivs bilden. Durch Erhöhen des Spiegelmündungswinkels kann der Sinuswert erhöht werden, und seine tatsächliche Obergrenze liegt bei etwa 72 Grad (der Sinuswert beträgt 0,95). Multipliziert mit dem Brechungsindex von Zedernöl 1,52 kann man erhalten, dass Der maximale NA-Wert liegt bei etwa 1,45, und wenn man ihn in die Berechnungsformel für die Auflösung einsetzt, kann man erhalten, dass die Grenzauflösung der XY-Ebene eines herkömmlichen Mikroskops etwa 0,2 um beträgt.
Der NA-Wert beeinflusst auch direkt die Helligkeit des Sichtfeldes des Mikroskops (B). Aus der Formel B∝NA2/M2 können wir ableiten, dass die Helligkeit mit zunehmender numerischer Apertur (NA) oder abnehmender Objektivvergrößerung (M) zunimmt.
Theoretisch sollten wir den höchstmöglichen NA-Wert anstreben, um eine bessere Auflösung in der XY-Ebene und eine bessere Sichtfeldhelligkeit zu erreichen. Allerdings hat alles zwei Seiten. Die Verbesserung der Auflösung der XY-Ebene verringert die Schärfentiefe der Z-Achse und das Beobachtungssichtfeld.
Mikroskope blicken im Allgemeinen vertikal nach unten. Wenn die konvexe Position und die konkave Position auf der Oberfläche des Objekts, die innerhalb des Durchmessers des Sichtfelds beobachtet werden, klar erkennbar sind, dann ist der Höhenunterschied zwischen dem konvexen Punkt und dem konkaven Punkt die Schärfentiefe. Nun, bei Mikroskopen gilt: Je größer die Schärfentiefe, desto besser. Je größer die Schärfentiefe, desto bessere und dreidimensionalere Bilder können bei der Beobachtung der Oberfläche unebener Objekte erhalten werden. Die große Schärfentiefe hilft uns, die mikroskopische Welt in vertikaler Richtung zu beobachten. Das heißt, die Z-Achsen-Informationen in der dreidimensionalen XYZ-Form.
Die Schärfentiefe ist die Tiefe des vorderen und hinteren Raums, die dem klaren Bild auf der Bildebene entspricht: dtot=(λ*n)/NA plus n/(M∗NA) * e, dtot: Schärfentiefe , NA: numerische Apertur, M: Gesamtvergrößerung, λ: Wellenlänge des Lichts (normalerweise λ=0.55um), n: Brechungsindex des Mediums zwischen der Probe und der Objektivlinse (Luft: n{{3 }}, Öl: n=1.52) Gemäß dieser Formel können wir wissen, dass die Schärfentiefe der Z-Achse umgekehrt proportional zum NA-Wert der XY-Ebene ist.
Neben der Schärfentiefe wird auch das Sichtfeld durch den NA-Wert beeinflusst. Der räumliche Bereich, der sichtbar ist, wenn das Instrument fest auf einen Punkt blickt, ist das Sichtfeld. Seine Berechnung steht in direktem Zusammenhang mit der Vergrößerung des Objektivs. Der tatsächliche Durchmesser des durch Beobachtung gesehenen Sichtfelds ist gleich dem Durchmesser des Sichtfelds. Geteilt durch die Vergrößerung der Objektivlinse zeigt das Okular das entsprechende Sichtfeld an, z. B. 10/18, d. h Die Vergrößerung beträgt das 10-fache und der Durchmesser des Sichtfelds beträgt 18 mm. Daher gilt bei der Bestimmung des Okulars: Je größer die Vergrößerung, desto kleiner das beobachtete Sichtfeld.
Die Auflösung der XY-Ebene ist die Analyse lokaler Details, und das Sichtfeld bestimmt unseren Beobachtungsbereich der Probe. Je größer das Sichtfeld, desto besser, aber durch die aktuelle Technologie begrenzt, müssen wir Hochleistungsobjektive verwenden, um gute NA-Werte zu erhalten, daher weisen Gesichtsfeld- und NA-Werte eine indirekte negative Korrelation auf.
