Was ist Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie?
Das Grundprinzip der Zwei-Photonen-Anregung ist: Bei hoher Photonendichte können fluoreszierende Moleküle zwei langwellige Photonen gleichzeitig absorbieren und nach einer kurzen Zeitspanne der sogenannten Lebensdauer des angeregten Zustands ein kurzwelligeres Photon emittieren . ; Der Effekt ist derselbe, als würde man ein fluoreszierendes Molekül mit einem Photon anregen, dessen Wellenlänge halb so lang ist wie die lange Wellenlänge. Für die Zweiphotonenanregung ist eine hohe Photonendichte erforderlich. Um Zellen nicht zu schädigen, werden in der Zwei-Photonen-Mikroskopie hochenergetische modengekoppelte gepulste Laser eingesetzt. Der von diesem Laser emittierte Laser hat eine hohe Spitzenenergie und eine niedrige Durchschnittsenergie, seine Pulsbreite beträgt nur 100 Femtosekunden und seine Frequenz kann 80 bis 100 Megahertz erreichen. Bei Verwendung einer Objektivlinse mit hoher numerischer Apertur zur Fokussierung der Photonen des gepulsten Lasers ist die Photonendichte im Brennpunkt der Objektivlinse am höchsten und die Zweiphotonenanregung erfolgt nur im Brennpunkt der Objektivlinse Das Zwei-Photonen-Mikroskop benötigt keine konfokale Lochblende, was die Effizienz der Fluoreszenzdetektion verbessert.
Bei allgemeinen Fluoreszenzphänomenen kann ein fluoreszierendes Molekül aufgrund der geringen Photonendichte des Anregungslichts nur ein Photon gleichzeitig absorbieren und dann durch einen Strahlungsübergang, bei dem es sich um eine Einzelphotonenfluoreszenz handelt, ein fluoreszierendes Photon emittieren. Beim Fluoreszenzanregungsprozess mit Laser als Lichtquelle kann Zwei-Photonen- oder sogar Mehrphotonen-Fluoreszenz auftreten. Zu diesem Zeitpunkt ist die Intensität der verwendeten Anregungslichtquelle hoch und die Photonendichte entspricht den Anforderungen fluoreszierender Moleküle, die zwei Photonen gleichzeitig absorbieren. Bei der Verwendung eines allgemeinen Lasers als Anregungslichtquelle reicht die Photonendichte immer noch nicht aus, um das Zwei-Photonen-Absorptionsphänomen zu erzeugen. Normalerweise wird ein gepulster Femtosekundenlaser verwendet, dessen Momentanleistung die Größenordnung von Megawatt erreichen kann. Daher ist die Wellenlänge der Zwei-Photonen-Fluoreszenz kürzer als die Wellenlänge des Anregungslichts, was dem Effekt entspricht, der durch Anregung bei der halben Anregungswellenlänge erzeugt wird.
