Konfokale Fluoreszenzmikroskopie verstehen
Das Grundprinzip der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie: Verwenden Sie eine Punktlichtquelle, um die Probe zu beleuchten und einen kleinen, gut definierten Lichtpunkt auf der Brennebene zu erzeugen. Die von dem Punkt nach der Beleuchtung emittierte Fluoreszenz wird von der Objektivlinse gesammelt und entlang des ursprünglichen Beleuchtungslichtwegs zum dichroitischen Spiegel zurückgeführt. bilden einen Strahlteiler. Das Spektrometer sendet die Fluoreszenz direkt an den Detektor. Vor der Lichtquelle und dem Detektor befindet sich jeweils ein Loch, das als Beleuchtungsloch bzw. Detektionsloch bezeichnet wird. Die geometrischen Abmessungen der beiden sind konsistent, etwa 100-200 nm; relativ zum Lichtpunkt auf der Brennebene sind die beiden konjugiert, d. h. der Lichtpunkt durchläuft eine Reihe von Linsen und kann letztendlich gleichzeitig auf das Beleuchtungsloch und das Detektionsloch fokussiert werden. Auf diese Weise kann das Licht aus der Brennebene im Bereich des Detektionslochs konzentriert werden, während das gestreute Licht von oberhalb oder unterhalb der Brennebene außerhalb des Detektionslochs blockiert wird und nicht abgebildet werden kann. Die Probe wird mit dem Laser Punkt für Punkt abgetastet, und die Photovervielfacherröhre hinter der Detektionslochblende erhält ebenfalls Punkt für Punkt das konfokale Bild des entsprechenden Lichts, das in ein digitales Signal umgewandelt und an den Computer übertragen und schließlich auf dem Bildschirm zu einem klaren konfokalen Bild der gesamten Brennebene zusammengefasst wird.
Jedes Bild in der Brennebene ist eigentlich ein optischer Querschnitt der Probe. Dieser optische Querschnitt hat immer eine bestimmte Dicke und wird auch als optischer Dünnschnitt bezeichnet. Da die Lichtintensität im Fokus viel größer ist als die Lichtintensität im Nichtfokus und das Licht in der Nichtfokusebene durch die Lochblende gefiltert wird, beträgt die Schärfentiefe des konfokalen Systems ungefähr Null. Durch Scannen entlang der Z-Achsenrichtung kann eine optische Tomographie realisiert werden, die den gewünschten zweidimensionalen optischen Schnitt am fokussierten Punkt der Probe beobachtet. Durch Kombinieren des Scannens in der XY-Ebene (Brennebene) mit dem Scannen in der Z-Achse (optische Achse), durch Ansammeln kontinuierlicher Ebenen zweidimensionaler Bilder und deren Verarbeitung mit spezieller Computersoftware kann ein dreidimensionales Bild der Probe erhalten werden.
Das heißt, das Detektionsloch und das Loch der Lichtquelle sind immer auf denselben Punkt fokussiert, so dass die außerhalb der Fokusebene angeregte Fluoreszenz nicht in das Detektionsloch gelangen kann.
Das Funktionsprinzip der Laser-Konfokalmikroskopie besteht in der Verwendung eines Lasers als Lichtquelle. Auf der Grundlage der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie werden ein Laser-Scan-Gerät und ein konjugiertes Fokussierungsgerät hinzugefügt. Das System wird von einem Computer gesteuert, um digitale Bilder zu erfassen und zu verarbeiten.
