Der Unterschied zwischen positivem und negativem Phasenkontrast in einem Mikroskop
Je nach Konfiguration und Art des Phasenrings, der in der hinteren Brennebene des Objektivs positioniert ist, können Proben in positivem oder negativem Phasenkontrast beobachtet werden. Dieses interaktive Tutorial untersucht die Beziehung zwischen Umgebung (S), Beugung (D) und daraus resultierenden hellen Partikeln (P-Wellen) sowie positive und negative Phasenkontrastmikroskopie. Darüber hinaus werden auch die Geometrie der Phasenplatte und repräsentative Beispielbilder präsentiert.
Wenn Menschen es jetzt in ihrer Arbeit verwenden, befinden sich die meisten Forscher im negativen Unterschied, und jetzt spielt der positive Unterschied in der aktuellen wissenschaftlichen Forschungsarbeit keine große Rolle.
Das Tutorial initialisiert das Phasenbild mit einem zufällig ausgewählten Muster, das im Phasenkontrastbildfenster erscheint, und die entsprechende Wellenbeziehung wird im linken Nachbar des Bildfensters angezeigt. Um das Lernprogramm zu bedienen, verwenden Sie den Mauszeiger, um die Übersetzung zwischen dem positiven und negativen Phasenkontrast oder dem Schieberegler für den Phasenkontrastmodus bei heller Beleuchtung zu verschieben. Wenn der Schieberegler verschoben wird, ändern die Bilder, die im Phasenkontrast-Bildfenster erscheinen, wie die Probe in dem durch den Schieberegler eingestellten aktuellen Bildgebungsmodus erscheint. Unterhalb des Wellenformdiagramms befindet sich außerdem eine Phasenplatte, die ihre Form ändert, um sie an den mit dem Schieberegler ausgewählten Bildgebungsmodus anzupassen. Um eine neue Probe anzuzeigen, verwenden Sie das Dropdown-Menü Ausgewählte Probe, um eine andere Probe auszuwählen.
Ein Diagramm der Phasenplattenkonfiguration, Wellenbeziehungen und Vektoren, die mit der Erzeugung von positiven und negativen Phasenkontrastbildern verbunden sind, ist in Abbildung 1 dargestellt. Beispiele für Proben, die mit diesen Techniken abgebildet wurden, sind ebenfalls gezeigt. In einer optischen Konfiguration mit positivem Phasenkontrast (obere Reihe des Bildes in Abbildung 1) passiert die umgebende (S)-Wellenfront die Phasenplatte, was zu einer Nettophasenverschiebung von 180 Grad Phasenvoreilung um 1/4 Wellenlänge führt ( 1 halbe Wellenlänge ). Fortgeschrittene Surround-Wellenfronten sind nun in der Lage, an der destruktiven Interferenz mit gebeugten (D) Wellen in der Zwischenbildebene teilzunehmen. In den meisten Fällen reicht das einfache Vorrücken der relativen Phase der umgebenden Wellenfront allein nicht aus, um in Nikon-Mikroskopen zur Erzeugung kontrastreicher Bilder zu führen. Denn die Amplitude der Surround-Wellen ist deutlich größer als die der gebeugten Wellen und unterdrückt das durch Interferenz erzeugte resultierende Bild um einen Bruchteil der Gesamtzahl der Wellen. Um die umgebende Wellenfront auf einen Wert zu reduzieren, der näher an der Amplitude der gebeugten Wellen liegt (und eine Interferenz in der Bildebene durchzuführen), wird die Opazität im Phasenring des Objektivs durch Aufbringen eines halbtransparenten Metalls (neutral zunehmende Dichte) erreicht ) Beschichtung Boden. Die Umgebungslichtwellen, die den Phasenring konstruktionsbedingt fast vollständig passieren, werden bei der Phasenkontrastmikroskopie durch die Opazität der Phasenplatte in ihrer Amplitude deutlich auf einen Wert im Bereich von 10 bis 30 Prozent der ursprünglichen Intensität reduziert.
Da die resultierende Partikelwelle durch die Interferenz* der umgebenden und gebeugten Wellenfronten erzeugt wird, ist die Amplitude der durch die Interferenz zwischen den auf der Bildebene ankommenden Wellenfronten erzeugten Partikel-(P)-Welle jetzt viel kleiner als die umgebende, wenn es sich um Sex handelt Dichtebeschichtung aufgebracht. Der Nettoeffekt besteht darin, die relative Phasendifferenz, die durch den Durchgang von aus der Bildebene austretendem Licht durch die Probe eingeführt wird, in eine Amplitudendifferenz (Intensitätsdifferenz) umzuwandeln. Da das menschliche Auge den Intensitätsunterschied als Kontrast interpretiert, ist die Probe nun im Okular des Mikroskops sichtbar und kann auch mit herkömmlichen Kamerasystemen oder digital mit CCD- oder CMOS-Geräten auf der Membran erfasst werden. Alle positiven Phasenkontrastsysteme verschieben selektiv die Phase der linearen umgebenden (S)-Wellenfront relativ zu der sphärischen gebeugten (D) Wellenfront. Proben mit einem höheren Brechungsindex als das umgebende Medium erscheinen auf einem neutralgrauen Hintergrund dunkler, während solche mit einem niedrigeren Brechungsindex als das schwimmende Medium heller erscheinen als der graue Hintergrund.
Um die räumliche Trennung der gebeugten Wellenfronten, die Phase und Amplitude in einem optischen Phasenkontrastsystem umgeben, zu modifizieren, wurde eine Anzahl von Phasenplattenkonfigurationen eingeführt. Da sich die Phasenplatte an oder sehr nahe an der hinteren Brennebene des Objektivs (Beugungsebene) befindet, muss alles Licht, das durch das Mikroskop fällt, durch diese Komponente laufen. Der Teil der Phasenplatte in ihrem ringförmigen Kondensorfokus wird als konjugierter Bereich bezeichnet, während der verbleibende Bereich als komplementärer Bereich bezeichnet wird. Der konjugierte Bereich enthält das Material, das für die Änderung der Phase des umgebenden (ungebeugten) Lichts um entweder plus oder minus 90 Grad in Bezug auf die gebeugte Wellenfront verantwortlich ist. Im Allgemeinen ist der Bereich des phasenkonjugierten Rings breiter (etwa 25 Prozent) als der Bereich, der durch das kondensierende Ringbild definiert ist, um die Menge an Umgebungslicht zu reduzieren, die sich zum komplementären Bereich ausbreitet.
Die meisten Phasenplatten, die von modernen Mikroskopherstellern erhältlich sind, sind solche, die durch Vakuumabscheidung dünner dielektrischer und metallischer Filme auf einer Glasplatte hergestellt oder direkt auf der Linsenoberfläche des Mikroskopobjektivs montiert werden. Die Rolle des dielektrischen Films besteht darin, das Licht zu phasen, während der Metallfilm die Intensität des ungebeugten Lichts dämpft. Einige Hersteller verwenden mehrere Antireflexbeschichtungen in Kombination mit dem Film, um die Blendung und Reflexion von Streulicht zurück in das optische System zu reduzieren. Wenn die Phasenplatte nicht auf der Oberfläche einer Linse ausgebildet ist, wird sie normalerweise zwischen aufeinanderfolgenden Linsen verkittet, die sich auf der Brennebene nahe der Rückseite des Objektivs befinden. Die Dicke und der Brechungsindex der dielektrischen, metallischen und antireflektierenden Beschichtungen sowie die des optischen Kitts werden sorgfältig ausgewählt, um die gewünschte Phasenverschiebung zwischen den komplementären und konjugierten Bereichen der Phasenplatte zu erzeugen. In optischer Hinsicht wird eine Phasenplatte, die die Phase relativ zum umgebenden Licht ändert, um Licht um 90 Grad (entweder positiv oder negativ) zu beugen, aufgrund des Effekts der optischen Wegdifferenz auf sie als Viertelwellenplatte bezeichnet.
Eine Übersicht über die Umkehrung der positiven Phase ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Kontrastplatte der positiven Phase (linke Seite von Abbildung 1) treibt die Surround-Welle um 1/4 Wellenlänge an, aufgrund des Erosionsrings in der Glasplatte, der dies kann Durch den oberen Pass in der hochbrechenden Platte wird der eingenommene physikalische Weg der Welle reduziert. Aufgrund der Wechselwirkung mit der Probe beträgt, wenn die gebeugten Probenstrahlen (D) verzögert werden, die optische Wegdifferenz zwischen den umlaufenden und gebeugten Wellen, die aus der Phasenplatte austreten, die halbe Wellenlänge mal 1/4 Wellenlänge. Das Nettoergebnis ist eine optische Wegdifferenz von 180- Grad zwischen den umgebenden und gebeugten Wellen, was zu einer destruktiven Interferenz für Proben mit hohem Brechungsindex zwischen den Bildebenen führt. Der Amplitudenverlauf für die der positiven Phase entgegengesetzte destruktive Interferenzwelle ist im oberen Diagramm von Abbildung 1 dargestellt. Die resultierende Partikel-(P)-Welle hat eine geringere Amplitude als die Umgebungs-(S)-Welle, wodurch das Objekt im Vergleich zu einer relativen erscheint dunklerer Hintergrund. Unten, rechts gezeigtes Bild von Zygnema-Grünalgen (mit DL gekennzeichnet). Der Vektor, der durch den Fortschritt der 1/4-Wellenlänge dargestellt wird, der als 90- Grad gegen den Uhrzeigersinn rotierende Surround-Welle in positivem Phasenkontrast angezeigt wird, erscheint zwischen der Figur und dem Bild in Abbildung 1.
Alternativ kann die Mikroskopoptik auch so hergestellt werden, dass sie eine entgegengesetzte negative Phase erzeugt, wie im unteren Teil von 1 gezeigt, in welchem Fall die umgebenden (S)-Wellen um eine Viertelwellenlänge relativ zu verzögert (eher als vorgerückt) werden die eine gebeugte (D) Welle. Infolgedessen erscheinen Proben mit hohen Brechungsindizes heller vor einem dunkleren grauen Hintergrund (siehe das untere Bild mit der Bezeichnung BM in Abbildung 1). Bei negativer Gegenphase enthält die objektive Phasenplatte einen erhabenen Ring, der die Phase verzögert (anstatt die Phase als positive Gegenphase vorzurücken) und eine Viertelwellenlänge relativ zur Phase der gebeugten Welle als Umgebungswelle nullter Ordnung durchlässt. Da die gebeugten Wellen beim Durchgang durch die Probe um eine Viertelwellenlänge verzögert wurden, wird der optische Wegunterschied zwischen den umgebenden und gebeugten Wellen eliminiert und die Probe mit hohem Brechungsindex interferiert konstruktiv in der Bildebene. Beachten Sie, dass die resultierende Partikelwelle (P) in der Amplitude höher ist als die Umgebungswelle (S) im negativen Phasenkontrast. Ebenfalls gezeigt ist eine negative Phasenumkehr, bei der der Umrundungswellenvektor eine 90-Grad-Drehung des Vektordiagramms im Uhrzeigersinn durchläuft.
