Technische Eigenschaften und Einsatzfähigkeiten des Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskops
Die Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie ist eine neue Technologie, die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie und Zwei-Photonen-Anregungstechnologie kombiniert.
Das Grundprinzip der Zwei-Photonen-Anregung ist: Bei hoher Photonendichte können fluoreszierende Moleküle zwei langwellige Photonen gleichzeitig absorbieren und nach einer kurzen Zeitspanne der sogenannten Lebensdauer des angeregten Zustands ein kurzwelligeres Photon emittieren . ; Der Effekt ist derselbe, als würde man ein fluoreszierendes Molekül mit einem Photon mit einer halb so großen Wellenlänge anregen. Für die Zweiphotonenanregung ist eine hohe Photonendichte erforderlich. Um Zellen nicht zu schädigen, werden in der Zwei-Photonen-Mikroskopie hochenergetische modengekoppelte gepulste Laser eingesetzt. Der von diesem Laser emittierte Laser hat eine hohe Spitzenenergie und eine niedrige Durchschnittsenergie, seine Pulsbreite beträgt nur 100 Femtosekunden und seine Periode kann 80 bis 100 Megahertz erreichen. Bei Verwendung einer Objektivlinse mit hoher numerischer Apertur zur Fokussierung der Photonen des gepulsten Lasers ist die Photonendichte im Brennpunkt der Objektivlinse am höchsten und die Zweiphotonenanregung erfolgt nur im Brennpunkt der Objektivlinse Das Zwei-Photonen-Mikroskop benötigt keine konfokale Lochblende, was die Effizienz der Fluoreszenzdetektion verbessert. Es handelt sich um eine wichtige Forschungsmethode in den Bereichen Morphologie, molekulare Zellbiologie, Neurowissenschaften und Pharmakologie.
1. Der Hintergrund der Entstehung der Zwei-Photonen-Mikroskopie – zwei Einschränkungen der traditionellen konfokalen Lasermikroskopie:
1) Eines ist das Phototoxizitätsphänomen: Da die konfokale Lochblende klein genug sein muss, um ein hochauflösendes Bild zu erhalten, und die kleine Blende einen großen Teil der von der Probe emittierten Fluoreszenz blockiert, einschließlich der von der Brennebene emittierten Fluoreszenz, das entsprechende Ja, das Anregungslicht muss stark genug sein, um ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten; und der hochintensive Laser führt dazu, dass der Fluoreszenzfarbstoff während des kontinuierlichen Scannens schnell verblasst und das Fluoreszenzsignal mit fortschreitendem Scannen immer schwächer wird.
2) Phototoxizität ist ein weiteres Problem. Unter Laserbestrahlung produzieren viele fluoreszierende Farbstoffmoleküle Zytotoxine wie Singulett-Sauerstoff oder freie Radikale, daher sollten die Scanzeit und die optische Leistungsdichte des Anregungslichts im Experiment begrenzt werden, um die Probendichte aufrechtzuerhalten. aktiv. Bei der Forschung an aktiven Proben sind diese Studien aufgrund der Photobleichung und Phototoxizität, insbesondere der verschiedenen Wachstums- und Entwicklungsstadien aktiver Proben, sehr begrenzt.
2. Warum sagen Sie, dass Zwei-Photonen-Mikroskope im Allgemeinen nicht mit ultravioletten Anregungslasern ausgestattet sein müssen?
Die Zwei-Photonen-Mikroskopie ist eine Fluoreszenzanregungstechnologie, die auf dem Zwei-Photonen-Anregungseffekt basiert: Fluoreszenzfarbstoffmoleküle können durch gleichzeitige Absorption von zwei Photonen niedriger Energie angeregt werden (das Zeitintervall zwischen zwei Photonen, die fluoreszierende Moleküle erreichen, beträgt weniger als 1 Femtosekunde). ), seine Anregungswirkung kann der Absorption eines hochenergetischen Photons der halben Wellenlänge entsprechen. Beispielsweise entspricht die Absorption zweier Photonen im roten Wellenlängenbereich der Absorption eines Moleküls im ultravioletten Bereich. Langwellige Photonen werden von Zellen nicht leicht absorbiert, sodass die Phototoxizität für lebende Zellen verringert wird und auch die Photobleichung verringert wird. Auf diese Weise übernimmt es nicht nur die Funktion der ultravioletten Anregung, sondern vermeidet auch die Schädigung der Probe durch ultraviolettes Licht.
3. Was ist das Besondere am Laser des Zwei-Photonen-Mikroskops?
Die Wahrscheinlichkeit einer Zwei-Photonen-Absorption hängt davon ab, wie genau die beiden einfallenden Photonen räumlich und zeitlich zusammenfallen (die beiden Photonen müssen innerhalb von 10-18 Sekunden eintreffen). Der Zwei-Photonen-Absorptionsquerschnitt ist klein und nur Fluorophore in Regionen mit einem großen Photonenfluss werden angeregt. Daher handelt es sich bei den meisten verwendeten Lasern um Titan-Saphir-Laser, die Scangeschwindigkeiten im Pikosekunden- oder Femtosekundenbereich erreichen können und eine sehr hohe Spitzenleistung und eine niedrige Durchschnittsleistung aufweisen, sodass Photobleichung und Phototoxizität reduziert oder eliminiert werden können. Das Wichtigste ist, eine sehr hohe Photonendichte in einem kleinen Bereich bereitzustellen, die die gleichzeitige Anregung zweier Photonen gewährleisten kann.
4. Welche Vorteile bietet die Zweiphotonenanregung?
1) Erhöhen Sie die Selektivität des Farbstoffs: Der Anregungslichtbereich des konfokalen Systemlasers (Ar, Ar/Kr, HeNe) beträgt 488 nm - 647 nm. Dies bedeutet, mit UV-angeregten Fluoreszenzfarbstoffen zu experimentieren, z. B. mit DAPI, Hoescht. Die Anregungswellenlänge von Zwei-Photonen ist doppelt so groß wie die von Einzel-Photonen, sodass durch Ultraviolett angeregte Farbstoffe durch Licht im nahen Infrarot angeregt werden können.
2) Photobleichung reduzieren: Aufgrund der Reduzierung der Photobleichung steigt die Erfolgsquote von Experimenten mit CFP/YFP für den Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET).
3) Es ist keine spezielle Objektivlinse erforderlich: Aus Hardware-Sicht sind für die Anregung UV-angeregter Farbstoffe mit der Wellenlänge des nahen Infrarotlichts keine speziellen UV-optischen Komponenten erforderlich.
4) Verbessern Sie das Signal-Rausch-Verhältnis: Die Wellenlänge des Anregungslichts und die Wellenlänge des emittierten Lichts weisen einen großen Unterschied auf, was das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert.
5) Lokalisiertes Bleichen im Brennpunkt: Da die Fluoreszenzanregung nur im Brennpunkt des Objektivs erfolgt, ist keine konfokale Lochblende erforderlich. Dadurch wird die Lichterkennung verbessert und Photobleichung findet nur im Brennpunkt statt.
6) Proben lassen sich leichter durchdringen: Licht mit Infrarotwellenlänge wird nicht so leicht von Zellen gestreut und kann tiefere Proben durchdringen.
5. Was ist im Vergleich zur konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie die größte Verbesserung durch die Zwei-Photonen-Mikroskopie?
1) Reduzierte Photobleichung.
2) Reduzierte Phototoxizität.
3) Es ist nicht leicht zu streuen und es ist einfacher, dicke Proben, wie z. B. Gehirnschnitte, zu durchdringen.
