Färbetechniken und mikroskopische Beobachtung von Mikroorganismen
Einfache Färbung von Bakterien
1 Ziele
1.1 Erlernen der grundlegenden Techniken des mikrobiellen Ausstrichs und der Färbung.
1.2 Die einfache Färbemethode von Bakterien beherrschen.
1.3 Die morphologischen Eigenschaften von Bakterien kennenlernen und das Wissen über die Verwendung von Ölspiegeln und aseptischen Operationstechniken festigen.
2 Prinzip Das Ausstreichen und Färben von Bakterien ist eine grundlegende Technik in mikrobiologischen Experimenten. Die Zellen von Bakterien sind klein und transparent, sie sind unter dem gewöhnlichen Lichtmikroskop nicht leicht zu erkennen und müssen gefärbt werden. Die Verwendung eines einzelnen Farbstoffs zum Färben der Bakterien, sodass der gefärbte Organismus und der Hintergrund einen klaren Farbunterschied bilden, sodass ihre Morphologie und Struktur deutlicher beobachtet werden können. Diese Methode ist einfach durchzuführen und eignet sich zur Beobachtung der allgemeinen Form des Organismus und der Anordnung der Bakterien. Alkalische Farbstoffe werden häufig zum einfachen Färben verwendet, da Bakterienzellen in neutralen, alkalischen oder schwach sauren Lösungen normalerweise negativ geladen sind und wenn alkalische Farbstoffe ionisiert werden, ist der färbende Teil ihrer Moleküle positiv geladen, sodass der färbende Teil der alkalischen Farbstoffe leicht an die Bakterien binden kann, um die Bakterien zu färben. Die gefärbten Bakterienzellen kontrastieren stark mit dem Hintergrund und sind unter dem Mikroskop leichter zu erkennen. Häufig verwendete Farbstoffe zum einfachen Färben sind Merocyaninblau, Kristallviolett und basisches zusammengesetztes Rot. Wenn Bakterien Zucker zersetzen und Säure produzieren, sinkt der pH-Wert des Mediums, die positive Ladung der Bakterien nimmt zu und kann dann zum Färben mit Rot, Säurerot oder Kongorot und anderen sauren Farbstoffen verwendet werden. Die Bakterien müssen vor dem Färben fixiert werden. Dies hat zwei Zwecke: Zum einen werden die Bakterien abgetötet und am Objektträger haften gelassen; zum anderen wird die Affinität der Bakterien zum Farbstoff erhöht. Üblicherweise werden zwei Methoden verwendet: Erhitzen und chemische Fixierung. Beim Fixieren wird versucht, die ursprüngliche Morphologie der Zellen beizubehalten.
3 Materialien
3.1 Stamm Bacillus subtilis 12-18h-Nähragar-Schrägkultur, Staphylococcus aureus etwa 24h-Nähragar-Schrägkultur, Escherichia coli 24h-Nähragar-Schrägkultur, Bäckerhefe-Agar-Schrägkultur.
3.2 Färbung: Lue-alkalische Methylenblau-Färbung (oder Ammoniumoxalat-Kristallviolett-Färbung), Karbolsäure-Verbindungs-Rot-Färbung.
3.3 Instrumente oder andere Utensilien Mikroskop, Alkohollampe, Objektträger, Impfring, Objektträgerhalter, doppelwandige Flasche (gefüllt mit Zedernöl und Xylol), Mikroskoppapier, physiologische Kochsalzlösung oder destilliertes Wasser usw.
4 Vorgehensweise: Ausstrich → Trocknen → Fixieren → Färben → Waschen → Trocknen → mikroskopische Untersuchung.
5 Schritte
5.1 Ausstrich Nehmen Sie zwei saubere und ölfreie Objektträger und geben Sie unter aseptischen Bedingungen jeweils einen kleinen Tropfen Kochsalzlösung (oder destilliertes Wasser) in die Mitte des Objektträgers. Verwenden Sie dann einen Impfring, um aseptisch vorzugehen. Nehmen Sie von Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus und Escherichia coli jeweils etwas Moos in den Wassertropfen, mischen Sie es und überziehen Sie es mit einem Film. Wenn Sie eine Bakteriensuspension (oder Flüssigkultur) ausstreichen möchten, können Sie 2 bis 3 Ringe direkt auf dem Objektträger impfen. Beachten Sie, dass die Kochsalzlösung (destilliertes Wasser) und die Bakterien nicht zu viel sein sollten und dass sie gleichmäßig und nicht zu dick verteilt sein sollten.
5.2 Trocknen: Bei Raumtemperatur natürlich trocknen. Es kann auch getrocknet werden, indem man es mit der beschichteten Seite nach oben leicht über einer Alkohollampe erhitzt. Gehen Sie jedoch nicht zu nahe an die Flamme, da eine zu hohe Temperatur die Morphologie der Bakterien zerstört.
5.3 Fixierung Bei der Heißtrocknung werden Fixierung und Trocknung wie beim Trocknen in einem Schritt zusammengefasst: Ausstreichen, trocknen und heiß fixieren.
5.4 Färben Legen Sie den Objektträger flach auf die Objektträgerablage und geben Sie 1 bis 2 Tropfen Färbelösung auf den Ausstrich (es ist angemessen, dass die Färbelösung den Ausstrichfilm gerade bedeckt). Färben Sie den Ausstrich 1 bis 2 Minuten lang mit Lü's Basic Mellanox Blue und etwa 1 Minute lang mit Carbonate Red (oder Ammoniumoxalat-Kristallviolett).
5.5 Spülen Gießen Sie die Färbelösung ab und spülen Sie vorsichtig mit Leitungswasser von einem Ende des Objektträgers, bis das vom Ausstrich herunterlaufende Wasser farblos ist. Lassen Sie das Wasser beim Spülen nicht direkt fließen, um die beschichtete Oberfläche zu waschen. Der Wasserfluss sollte nicht zu schnell oder zu groß sein, um ein Ablösen des Ausstrichfilms zu vermeiden.
5.6 Trocknen Schütteln Sie die Wassertropfen auf dem Objektträger ab, damit er natürlich trocknet. Sie können ihn auch mit einem Föhn oder saugfähigem Papier trockensaugen (achten Sie darauf, den Bakterienkörper nicht abzuwischen). 5.7 Mikroskopische Untersuchung Der Ausstrich wird getrocknet und mikroskopisch untersucht. Der Ausstrich muss vollständig trocken sein, bevor er mit einem Ölmikroskop untersucht werden kann.
6 Ergebnisse Zeichnen Sie die Morphologie von E. coli und Micrococcus garciniae nach einmaliger Färbung.
Gram-Färbung
1. Zweck
1.1 Das Prinzip der Gram-Färbung und ihre Bedeutung bei der Klassifizierung und Identifizierung von Bakterien verstehen.
1.2 Erlernen und Beherrschen der Gram-Färbetechnik und Festigen der Kenntnisse im Umgang mit der Öllinse des Lichtmikroskops.
