Anforderungen an die Vorbereitung von Routineproben für die Mikroskopie
Das konfokale Mikroskop ist ein bahnbrechendes neues High-Tech-Produkt, das in den 1980er Jahren entwickelt wurde und heute eines der wichtigsten Analyseinstrumente in der Molekularbiologie und den Biowissenschaften ist. Die konfokale Mikroskopie basiert auf der Fluoreszenzmikroskop-Bildgebung mit einem zusätzlichen Laser-Scanning-Gerät, wobei ein Computer zur Bildverarbeitung verwendet wird, um Fluoreszenzbilder der Mikrostruktur innerhalb von Zellen oder Geweben zu erhalten und um Veränderungen in der Morphologie vieler physiologischer Signalmaschinen auf subzellulärer Ebene zu beobachten. Werden Sie zu einem leistungsstarken Forschungsinstrument in den Bereichen Morphologie, molekulare Zellbiologie, Neurowissenschaften, Pharmakologie, Genetik und anderen wissenschaftlichen Bereichen.
Die Probenvorbereitung für die konfokale Mikroskopie ist ein entscheidender Schritt vor der Detektion. Proben müssen mit Fluoreszenzsonden (einfach, doppelt, dreifach) markiert werden.
Die
Bei den Proben kann es sich um fixiertes oder lebendes Gewebe oder um fixierte oder lebende adhärente Kulturen handeln. Zellen sollten auf konfokalen speziellen kleinen Kulturschalen oder Deckgläschen kultiviert werden. Zellen suspendieren, Scheiben schütteln oder fallen lassen und mit Deckgläsern abdecken. Die Zda-Dicke der Probe beträgt etwa 1–2 mm, die Dicke des verwendeten Deckglases sollte weniger als 0,17 mm betragen und die Dicke des Objektträgerglases sollte zwischen 0,8–1,2 liegen mm, und die Oberfläche ist glatt, die Dicke ist gleichmäßig und es gibt keine offensichtliche Interferenzfluoreszenz. Für fixierte Proben wird häufig Eindeckmedium verwendet, und zum Einbetten wird üblicherweise in PBS mit einem pH-Wert von 8.5-9 zubereitetes Glycerin verwendet.
Anforderungen an die routinemäßige Probenvorbereitung:
1. Auswahl der Farbstoffe
Da das konfokale Mikroskop einen Einzelwellenlängenlaser als Lichtquelle verwendet, sollte sich die Auswahl der Fluoreszenzfarbstoffe an der Wellenlänge des Lasers orientieren, mit dem das konfokale Mikroskop ausgestattet ist. Wenn in derselben Probe mehrere Fluoreszenzfarbstoffe vorhanden sind, sollte auch deren Emissionswellenlänge so weit wie möglich berücksichtigt werden. Überlappen Sie nicht, um Farbüberschneidungen zu vermeiden.
2. Auswahl des Probenträgers
Im Allgemeinen ist die Hochleistungsobjektivlinse des konfokalen Mikroskops eine Öllinse, ihre numerische Apertur ist klein und der Arbeitsabstand zwischen der Linse und der Probe darf nicht mehr als 0,17 mm betragen. Objektträger und Deckgläser sind in Ordnung. Wenn es sich um suspendierte Zellen oder suspendierte Partikel handelt, kann eine Petrischale für ein konfokales Mikroskop verwendet werden, um die Probe zur Beobachtung zu transportieren.
3. Auswahl des Eindeckmediums
Wenn die Probe nur einmal beobachtet werden muss und die Fluoreszenz nicht leicht gelöscht werden kann, können Sie eine bestimmte Konzentration der Glycerinmischung wählen, um den Objektträger abzudichten. Wenn die Probe über einen längeren Zeitraum gelagert und mehrmals entnommen werden muss, sollte ein Anti-Fluoreszenz-löschendes Eindeckmedium ausgewählt werden, um den Verlust von Fluoreszenzsignalen zu reduzieren.
