Prinzipien der Laser-Konfokalmikroskopie (LSCM)
Ein konfokales Lasermikroskop verwendet ein hinter der Lichtquelle platziertes Beleuchtungsloch und ein vor dem Detektor platziertes Detektionsloch, um Punktbeleuchtung und Punktdetektion zu erreichen. Licht von der Lichtquelle wird durch Licht, das durch das Beleuchtungsloch emittiert wird, auf einen Punkt in der Brennebene der Probe fokussiert, und von diesem Punkt emittierte Fluoreszenz wird innerhalb des Detektionslochs abgebildet, und jegliches außerhalb dieses Punkts emittierte Licht wird durch das Detektionsloch blockiert. Das Beleuchtungsloch und das Detektionsloch sind für den beleuchteten oder detektierten Punkt konjugiert, sodass der detektierte Punkt der konfokale Punkt ist und die Ebene, in der sich der detektierte Punkt befindet, die konfokale Ebene ist. Der Computer zeigt den detektierten Punkt in Form eines Bildpunkts auf dem Computerbildschirm an. Um ein vollständiges Bild zu erzeugen, tastet ein Scansystem im optischen Pfad die Brennebene der Probe ab und erzeugt so ein vollständiges konfokales Bild. Solange der Trägertisch entlang der Z-Achse auf und ab bewegt wird, wird eine neue Ebene der Probe in die konfokale Ebene verschoben und die neue Ebene der Probe auf dem Monitor abgebildet. Während sich die Z-Achse weiter bewegt, werden aufeinanderfolgende Lichtschnittbilder von verschiedenen Ebenen der Probe aufgenommen.
Das herkömmliche optische Mikroskop verwendet eine Feldlichtquelle. Das Bild jedes Punkts auf der Probe wird durch Beugung oder Streuung des Lichts von benachbarten Punkten gestört. Das konfokale Laser-Scan-Mikroskop verwendet einen Laserstrahl, der durch ein beleuchtetes Pinhole geleitet wird, um eine punktförmige Lichtquelle auf der Probe zu erzeugen. Jeder Punkt der inneren Brennebene wird auf der Probe gescannt. Auf dem bestrahlten Punkt wird das Bild des Detektions-Pinholes erzeugt. Durch eine Lichtvervielfachungsröhre (PMT) oder ein kaltgekoppeltes Bauteil (cCCD) wird das Bild Punkt für Punkt oder Zeile für Zeile des Detektions-Pinholes empfangen. Auf dem Computerbildschirm wird schnell ein Fluoreszenzbild erzeugt. Das Beleuchtungs-Pinhole und das Detektions-Pinhole sind in Bezug auf die Brennebene der Objektivlinse konjugiert. Die Punkte in der Brennebene werden gleichzeitig auf das Beleuchtungs-Pinhole und das Emissions-Pinhole fokussiert. Punkte außerhalb der Brennebene werden bei der Abbildung nicht in das Detektions-Pinhole aufgenommen. Das erhaltene konfokale Bild ist also der optische Querschnitt der Probe und überwindet die Nachteile des unscharfen Bilds eines herkömmlichen Mikroskops.
Vom Grundprinzip her ist das Laser-Konfokalmikroskop ein modernes optisches Mikroskop. In der Technologie weist es gegenüber dem herkömmlichen Lichtmikroskop folgende Verbesserungen auf.
1. Verwenden Sie einen Laser als Lichtquelle, da die Monochromasie des Lasers sehr gut ist und die Wellenlänge des Lichtquellenstrahls gleich ist, wodurch die chromatische Aberration grundsätzlich eliminiert wird.
2. Durch den Einsatz konfokaler Technologie wird in der Brennebene der Objektivlinse in der Mitte eine kleine Öffnung in der Blende angebracht, wodurch Streulicht außerhalb der Brennebene blockiert wird, wodurch die sphärische Aberration eliminiert und die chromatische Aberration weiter eliminiert wird.
3. Konfokales Lasermikroskop verwendet Punktabtasttechnologie, um die Probe im zwei- oder dreidimensionalen Raum in unzählige Punkte zu zerlegen. Ein sehr kleiner Laserstrahl (Punktlichtquelle) scannt Punkt für Punkt, Zeile für Zeile und erzeugt dann durch die Kombination eines Mikrocomputers ein ganzes ebenes oder dreidimensionales Bild. Das herkömmliche Lichtmikroskop ist eine Feldlichtquelle, die unter einmaliger Abbildung die Proben an jedem Punkt des Bildes bildet, wo sich die Punkte der gebeugten und gestreuten Lichtinterferenz befinden. Die Klarheit und Präzision dieser beiden Bilder sind nicht vergleichbar.
4. Erfassung und Verarbeitung optischer Signale mit einem Computer und Verstärkung der Signale mit einem Photomultiplier
Beim Laser-Konfokalmikroskop ersetzt der Computer das menschliche Auge oder die Kamera zur Beobachtung und Videoaufzeichnung. Die erhaltenen Bilder werden digitalisiert und können im Computer verarbeitet werden, um die Klarheit der Bilder noch einmal zu verbessern. Darüber hinaus können durch die Verwendung von Photomultiplier-Röhren sehr schwache Signale verstärkt werden, wodurch die Empfindlichkeit erheblich verbessert wird. Als Ergebnis der kombinierten Verwendung der oben genannten Technologien kann man sagen, dass das LSCM das fortschrittlichste Mikroskop der Welt ist. Man kann sagen, dass das LSCM die Kombination aus Mikroskop-Produktionstechnologie, photoelektrischer Technologie und Computertechnologie ** ist und das unvermeidliche Produkt der Entwicklung moderner Technologie ist.
