Prinzip und Aufbau des Fluoreszenzmikroskops
Das Fluoreszenzmikroskop verwendet eine Punktlichtquelle mit hoher Lichtausbeute, die eine bestimmte Lichtwellenlänge (z. B. ultraviolettes Licht 3650 Zoll oder violettblaues Licht 4200 Zoll) durch ein Farbfiltersystem als Anregungslicht aussendet und die fluoreszierenden Substanzen in der Probe anregt emittieren verschiedene Fluoreszenzfarben. Anschließend erfolgt die Beobachtung durch Vergrößerung von Objektiv und Okular. Auf diese Weise ist es auch bei schwacher Fluoreszenz vor stark kontrastreichen Hintergründen gut erkennbar und hochempfindlich und wird hauptsächlich zur Untersuchung der Zellstruktur und -funktion sowie der chemischen Zusammensetzung verwendet. Die Grundstruktur eines Fluoreszenzmikroskops besteht aus einem gewöhnlichen optischen Mikroskop und einigen Zubehörteilen (z. B. einer Fluoreszenzlichtquelle, einem Anregungsfilter, einem bichromatischen Strahlteiler und einem Sperrfilter usw.). Fluoreszierende Lichtquellen – verwenden normalerweise Ultrahochdruck-Quecksilberlampen (50-200W), die Licht verschiedener Wellenlängen emittieren können. Da jedoch jede fluoreszierende Substanz eine Anregungslichtwellenlänge hat, die die stärkste Fluoreszenz erzeugt, müssen Anregungsfilter (normalerweise ultraviolette, violette, blaue und grüne Anregungsfilter) hinzugefügt werden, um nur eine bestimmte Wellenlänge des Anregungslichts durchzulassen und zu beleuchten die Probe, während alles andere Licht absorbiert wird. Nach der Bestrahlung mit angeregtem Licht emittiert jede Substanz in sehr kurzer Zeit sichtbare Fluoreszenz mit einer längeren Wellenlänge als die Bestrahlung. Fluoreszenz ist spezifisch und im Allgemeinen schwächer als Anregungslicht. Um spezifische Fluoreszenz zu beobachten, muss hinter der Objektivlinse ein Sperrfilter (oder Unterdrückungsfilter) angebracht werden. Es hat zwei Funktionen: Erstens absorbiert es Anregungslicht und blockiert es am Eindringen in das Okular, um eine Störung der Fluoreszenz und eine Schädigung der Augen zu vermeiden. Zweitens selektiert und lässt es spezifische Fluoreszenz durch und zeigt eine bestimmte Fluoreszenzfarbe an. Für die gemeinsame Verwendung müssen beide Filtertypen ausgewählt werden.
Basierend auf ihrem Strahlengang werden zwei Arten von Fluoreszenzmikroskopen unterschieden:
1. Transmissionsfluoreszenzmikroskop: Die Anregungslichtquelle wird über einen Kondensor durch das Probenmaterial geleitet, um Fluoreszenz anzuregen. Häufig verwendete Dunkelfeld-Lichtkollektoren oder gewöhnliche Lichtkollektoren können zur Einstellung des Reflektors verwendet werden, um Anregungslicht und Seitenlicht auf die Probe umzuwandeln. Dies ist ein relativ altmodisches Fluoreszenzmikroskop. Ihr Vorteil besteht darin, dass die Fluoreszenz bei geringer Vergrößerung stark ist, während ihr Nachteil darin besteht, dass die Fluoreszenz mit zunehmender Vergrößerung schwächer wird. Daher eignet es sich besser für die Beobachtung größerer Probenmaterialien.
2. Fallstrahl-Fluoreszenzmikroskop Dies ist ein neuer Typ eines Fluoreszenzmikroskops, der in der Neuzeit entwickelt wurde. Im Gegensatz zum vorherigen Fall fällt das Anregungslicht von der Objektivlinse auf die Oberfläche der Probe, wobei dieselbe Objektivlinse als Beleuchtungskondensor und die Objektivlinse zum Sammeln der Fluoreszenz verwendet werden. Dem Strahlengang muss ein zweifarbiger Strahlteiler hinzugefügt werden, der in einem 45-Grad-Winkel zum leichten Uran steht. Das Anregungslicht wird in die Objektivlinse reflektiert und auf die Probe konzentriert. Die von der Probe erzeugte Fluoreszenz sowie das von der Oberfläche der Objektivlinse und des Deckglases reflektierte Anregungslicht treten gleichzeitig in die Objektivlinse ein und kehren zum dichroitischen Strahlteiler zurück, wodurch Anregung und Fluoreszenz getrennt werden. Die Restanregung wird dann vom Sperrfilter absorbiert. Wenn unterschiedliche Anregungsfilter/Zweifarbstrahlteiler/Sperrfilterkombinationen verwendet werden, können diese den Anforderungen unterschiedlicher Fluoreszenzreaktionsprodukte gerecht werden. Der Vorteil dieses Fluoreszenzmikroskops besteht darin, dass die Sichtfeldbeleuchtung gleichmäßig ist, die Abbildung klar ist und die Fluoreszenz umso stärker ist, je größer die Vergrößerung ist.
