Multiphotonen-Mikroskopie-Bildgebungstechnologie: Polarisations-aufgelöste Mikroskopie der zweiten Harmonischen-und deren Bildverarbeitung
In nichtlinearen optischen Mikroskopen wird üblicherweise die Bildgebung der zweiten Harmonischen (SHG) zur Beobachtung endogener Faserstrukturen verwendet, und die Intensität der SHG hängt weitgehend vom relativen Winkel zwischen der Polarisationsrichtung des einfallenden Strahls und der Orientierungsachse des Zielmoleküls ab. Daher kann die polarisationsbasierte SHG-Bildgebung (P-SHG) strukturelle Informationen über Zielmoleküle erhalten, indem die funktionale Beziehung zwischen der SHG-Signalintensität und dem Polarisationszustand des einfallenden Strahls analysiert wird. Es wird heute als wichtiges Werkzeug für medizinische und biologische Analysen verwendet.
Einfache SHG-Bilder können durch herkömmliche Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenzmikroskopie (TPM) erhalten werden. Die meisten TPM-Systeme verwenden immer noch ein Einzelstrahl-Scanverfahren, das auf einem beweglichen Spiegel basiert, dessen Zeitauflösung von der physikalischen Bewegungsgeschwindigkeit des Spiegels abhängt. Um eine schnellere Bildgebung zu erreichen, kann das TPM-System auch ein Mehrstrahl-Scanverfahren anwenden (Abbildung 1A), darunter die Verwendung einer rotierenden Scheibenscaneinheit. Diese Einheit besteht aus einem koaxialen Mikrolinsen-Drehteller und einem Lochblenden-Drehteller, wobei die Mikrolinsen und Lochblenden auf jedem Drehteller eins-zu-eins entsprechen.
Wenn der Laser den Mikrolinsen-Drehteller passiert, deckt die Wellenfront mehrere Mikrolinsen ab. Verschiedene Mikrolinsen fokussieren verschiedene Teile der Wellenfront auf unterschiedliche Positionen und passieren entsprechende Nadellöcher, wodurch mehrere Mikrostrahlen entstehen. Diese auf die Probe treffenden Mikrostrahlen können gleichzeitig mehrere Signale anregen. Diese Signale kehren entlang des Mikroskopsystems zurück, passieren erneut die Lochblende und werden schließlich vom dichroitischen Spiegel zwischen den beiden Drehtellern in das Detektionsgerät reflektiert. Allerdings verfügt der häufig als Lichtquelle verwendete modengekoppelte Titan-Saphir-Laser über eine unzureichende Energie, was die Anzahl der Anregungsstrahlen begrenzt und zu einem kleinen effektiven Sichtfeld (FOV) für TPM (TPM-SD) bei Verwendung einer rotierenden Scaneinheit führt.
Ai Goto et al. Ziel war es, mithilfe des TPM-SD-Systems eine Hochgeschwindigkeits-P-SHG-Bildgebung mit einem großen Sichtfeld (FOV) zu erreichen. Daher wurde eine Yb-basierte Laserquelle mit höherer Spitzenleistung in das TPM-SD-System eingeführt.
Dies ist ein schematisches Diagramm des von ihnen entwickelten TPM-SD-Systems. Die Lichtquelle des Systems ist ein Yb-basierter Laser, der Femtosekundenpulse mit einer Mittenwellenlänge von 1042 nm, einer durchschnittlichen Leistung von 4 W, einer Pulsbreite von 300 fs und einer Wiederholungsrate von 10 MHz erzeugt. Das System passt zunächst die Laserleistung über eine Halbwellenplatte und einen Glan-Laserpolarisator an und weitet den Strahl dann über einen Strahlaufweiter auf. Der aufgeweitete Strahl wird in die Drehtisch-Scaneinheit eingeleitet und mehrere aus der Scaneinheit austretende Mikrostrahlen werden durch ein Wasserimmersionsobjektiv auf mehrere Punkte der Probe fokussiert. Um den Polarisationszustand des Lichtstrahls an der Objektivlinse einzustellen, werden eine Halbwellenplatte und eine Viertelwellenplatte im Strahlengang des Anregungsstrahls platziert.
