Vorteile der Laser-Scan-Multiphotonenmikroskopie erweitert
Das Laser-Scan-Multiphotonenmikroskop stellt eine wesentliche Verbesserung der optischen Mikroskopie dar, vor allem hinsichtlich der Möglichkeit, die Tiefenstruktur lebender und fixierter Zellen und Gewebe zu beobachten und klare und scharfe mehrschichtige Z-Ebenen-Strukturen, d. h. optische Scheiben, zu erhalten, aus denen sich eine dreidimensionale feste Struktur der Probe erstellen lässt. Bei der konfokalen Mikroskopie wird eine Laserlichtquelle verwendet, die so ausgedehnt wird, dass sie die gesamte hintere Brennebene der Objektivlinse ausfüllt, und dann durch das Linsensystem der Objektivlinse läuft, um in sehr kleinen Punkten auf der Brennebene der Probe zu konvergieren. Abhängig von der numerischen Apertur der Objektivlinse beträgt der Durchmesser des hellen Beleuchtungspunkts etwa 0,25 bis 0,8 μm und die Tiefe etwa 0,5 bis 0,5 bis 1,5 μm. Die Größe des konfokalen Punkts wird durch das Mikroskopdesign, die Laserwellenlänge, die Eigenschaften der Objektivlinse, die Zustandseinstellungen der Scaneinheit und die Art der Probe bestimmt. Feldmikroskope haben einen großen Beleuchtungsbereich und eine große Beleuchtungstiefe, während konfokale Mikroskope die Beleuchtung auf einen einzigen Brennpunkt in der Brennebene konzentrieren. Der grundlegendste Vorteil eines konfokalen Mikroskops ist die Fähigkeit, feine optische Schnitte aus dicken fluoreszierenden Proben (bis zu 50 μm oder mehr) mit Schnittdicken von etwa 0,5 bis 1,5 μm herzustellen. Eine Reihe von optischen Schnittbildern kann erhalten werden, indem die Probe mit dem Z-Achsen-Schrittmotor des Mikroskops auf und ab bewegt wird. Die Erfassung der Bildinformationen wird in der ersten Ebene gesteuert und nicht durch Signale gestört, die von anderen Stellen der Probe ausgehen. Nach dem Entfernen der Auswirkungen der Hintergrundfluoreszenz und der Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses sind Kontrast und Auflösung des konfokalen Bildes im Vergleich zu herkömmlichen feldbeleuchteten Fluoreszenzbildern deutlich verbessert. In vielen Proben sind viele komplizierte Strukturkomponenten miteinander verflochten und bilden komplexe Systeme, aber sobald genügend optische Schnitte erfasst werden können, können wir sie mithilfe von Software dreidimensional rekonstruieren. Diese experimentelle Methode wird in der biologischen Forschung häufig verwendet, um die komplexen strukturellen und funktionellen Beziehungen zwischen Zellen oder Geweben aufzuklären.
