Kenntnisse im Zusammenhang mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie
Das Grundprinzip der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie besteht darin, die Probe mit einer Punktlichtquelle zu bestrahlen und so einen genau definierten kleinen Fleck auf der Brennebene zu erzeugen. Die vom Fleck nach der Bestrahlung emittierte Fluoreszenz wird von der Objektivlinse gesammelt und entlang des ursprünglichen Bestrahlungspfads an das Spektrophotometer zurückgesendet, das aus einem bidirektionalen Farbspiegel besteht. Das Spektrophotometer sendet Fluoreszenz direkt an den Detektor. Vor der Lichtquelle und dem Detektor befinden sich zwei Nadellöcher, die als Beleuchtungsnadellöcher bzw. Detektionsnadellöcher bezeichnet werden. Die geometrischen Abmessungen der beiden sind konsistent, etwa 100-200nm; Im Vergleich zum Lichtpunkt auf der Brennebene sind die beiden konjugiert, was bedeutet, dass der Lichtpunkt eine Reihe von Linsen durchläuft und letztendlich gleichzeitig sowohl auf die Beleuchtungslochblende als auch auf die Detektionslochblende fokussieren kann. Auf diese Weise kann Licht aus der Brennebene im Bereich des Detektionslochs konvergieren, während Streulicht von oberhalb oder unterhalb der Brennebene außerhalb des Detektionslochs blockiert wird und nicht abgebildet werden kann. Indem die Probe Punkt für Punkt mit einem Laser abgetastet wird, erhält die Photomultiplierröhre nach der Erkennung der Lochblende auch Punkt für Punkt das entsprechende konfokale Bild des Lichts, das in ein digitales Signal umgewandelt und an den Computer übertragen wird. Schließlich wird auf dem Bildschirm ein klares konfokales Bild der gesamten Brennebene synthetisiert.
Jedes Brennebenenbild ist eigentlich ein optischer Querschnitt der Probe, der immer eine bestimmte Dicke aufweist, auch optischer Dünnschnitt genannt. Aufgrund der Tatsache, dass die Lichtintensität am Brennpunkt viel größer ist als die am Nicht-Brennpunkt und das Licht außerhalb der Brennebene durch Lochblenden herausgefiltert wird, beträgt die Schärfentiefe des konfokalen Systems ungefähr Null. Durch Scannen entlang der Z-Achsenrichtung kann eine optische Tomographie erreicht werden, die einen zweidimensionalen optischen Schnitt im Brennpunkt der beobachteten Probe erzeugt. Durch die Kombination des Scannens der XY-Ebene (Brennebene) mit dem Scannen der Z-Achse (optische Achse) kann ein dreidimensionales Bild der Probe erhalten werden, indem fortlaufende Schichten zweidimensionaler Bilder gesammelt und mit spezieller Computersoftware verarbeitet werden.
Die Detektionslochblende und die Lichtquellenlochblende sind immer auf den gleichen Punkt fokussiert, so dass außerhalb der Fokussierungsebene angeregte Fluoreszenz nicht in die Detektionsblende gelangen kann.
Der einfache Ausdruck des Funktionsprinzips der konfokalen Lasermikroskopie besteht darin, dass sie einen Laser als Lichtquelle verwendet und auf der Grundlage der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung ein Laserscangerät und ein konjugiertes Fokussiergerät hinzufügt. Es handelt sich um ein computergesteuertes System zur digitalen Bilderfassung und -verarbeitung.
