Einführung in die Fluoreszenzmikroskopie
Bei der Fluoreszenzmikroskopie wird das mit Fluorescein gefärbte Objekt mit kurzwelligem Licht bestrahlt, so dass es zur Erzeugung langwelliger Fluoreszenz angeregt und dann beobachtet wird. In einem Fluoreszenzmikroskop muss das Anregungslicht einer bestimmten Wellenlänge aus dem Beleuchtungslicht der Probe ausgewählt werden, um Fluoreszenz zu erzeugen, und dann muss die Fluoreszenz zur Beobachtung vom Mischlicht aus Anregungslicht und Fluoreszenz getrennt werden. Daher spielt das Filtersystem eine äußerst wichtige Rolle bei der Auswahl einer bestimmten Wellenlänge. Fluoreszenzmikroskope werden häufig in der Biologie, Medizin und anderen Bereichen eingesetzt.
1. Die Hauptkomponenten des Fluoreszenzmikroskops:
(A) Lichtquelle: Die Lichtquelle strahlt Licht verschiedener Wellenlängen (von Ultraviolett bis Infrarot) aus. Die
(B) Anregungsfilter-Lichtquelle: Durch das Licht einer bestimmten Wellenlänge kann die Probe Fluoreszenz erzeugen, während Licht blockiert wird, das zur Anregung der Fluoreszenz unbrauchbar ist. Die
(C) Fluoreszierende Proben: im Allgemeinen mit fluoreszierenden Pigmenten gefärbt. Die
(D) Sperrfilter: Blockiert das Anregungslicht, das nicht von der Probe absorbiert wird, und lässt die Fluoreszenz selektiv durch. Einige Wellenlängen werden in der Fluoreszenz selektiv durchgelassen.
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2. Klassifizierung von Fluoreszenzmikroskopen:
Fluoreszenzmikroskope werden im Allgemeinen in zwei Typen unterteilt: Transmission und Epi-Emission:
A. Übertragungstyp: Das Anregungslicht kommt von der Unterseite des zu untersuchenden Objekts, und der Kondensor ist ein Dunkelfeldkondensor, sodass das Anregungslicht nicht in die Objektivlinse eintritt, sondern die Fluoreszenz in die Objektivlinse. Bei niedrigen Vergrößerungen ist es hell, bei hohen Vergrößerungen jedoch dunkel. Es ist schwierig, in Ölimmersion und Zentrierung zu arbeiten. Bei niedrigen Vergrößerungen ist es besonders schwierig, den Beleuchtungsbereich zu bestimmen, es kann jedoch zu einem sehr dunklen Sichtfeldhintergrund kommen. Die Übertragungsart wird nicht für nicht transparente Objekte verwendet. Die
B. Epi-Typ: Der Übertragungstyp ist derzeit fast verschwunden. Die meisten neuen Fluoreszenzmikroskope sind vom Epi-Typ. Die Lichtquelle kommt von oberhalb des zu prüfenden Objekts und im Strahlengang befindet sich ein Strahlteiler, so dass es sowohl für die Prüfung transparenter als auch undurchsichtiger Objekte geeignet ist. Da die Objektivlinse als Kondensorlinse fungiert, ist sie nicht nur einfach zu bedienen, sondern kann auch eine gleichmäßige Ausleuchtung des gesamten Sichtfelds von niedriger bis hoher Vergrößerung erreichen. Die
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3. Vorsichtsmaßnahmen für die Durchleuchtung
A. Eine langfristige Bestrahlung mit Anregungslicht führt zu einer Schwächung und Löschung der Fluoreszenz. Verkürzen Sie daher die Beobachtungszeit so weit wie möglich und verwenden Sie eine Abschirmung, um das Anregungslicht abzudecken, wenn Sie vorübergehend nicht beobachten. Die
B. Verwenden Sie bei der Beobachtung mit einem Ölimmersionsobjektiv „nicht fluoreszierendes Öl“. Die
C. Die Fluoreszenz ist fast immer schwach und sollte in einem dunklen Raum durchgeführt werden. Die
D. Es ist am besten, einen Spannungsstabilisator in das Netzteil einzubauen, da sonst die instabile Spannung nicht nur die Lebensdauer der Quecksilberlampe verringert, sondern auch die Wirkung der Mikroskopinspektion beeinträchtigt. Die
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4. Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie
1. Vorbereitungsanforderungen für Fluoreszenzmikroskopproben
A. Glasobjektträger
Die Dicke des Glasobjektträgers sollte zwischen 0,8 und 1,2 mm liegen. Ein zu dicker Objektträger absorbiert einerseits mehr Licht, andererseits kann das Anregungslicht nicht auf die Probe konzentriert werden. Die Objektträger müssen glatt, gleichmäßig dick und frei von offensichtlicher Autofluoreszenz sein. Manchmal werden Objektträger aus Quarzglas verwendet. Die
B. Schutzglas
Die Dicke des Deckglases beträgt etwa 0,17 mm, glatt. Um das Anregungslicht zu verstärken, kann auch ein trockenes Deckglas verwendet werden, bei dem es sich um ein spezielles Deckglas handelt, das mit mehreren Schichten von Substanzen (z. B. Magnesiumfluorid) beschichtet ist, die unterschiedliche Interferenzwirkungen auf Licht unterschiedlicher Wellenlänge haben, wodurch das Fluoreszenz verläuft reibungslos. Anregungslicht wird durchgelassen und das reflektierte Anregungslicht regt die Probe an. Die
C. Probe
Gewebeschnitte oder andere Proben sollten nicht zu dick sein. Ist sie zu dick, wird der größte Teil des Anregungslichts im unteren Teil der Probe verbraucht, während der obere direkt von der Objektivlinse beobachtete Teil nicht vollständig angeregt werden kann. Darüber hinaus können Zellüberlappungen oder Verunreinigungen das Urteil beeinträchtigen. Die
D. Montagemittel
Glycerin wird üblicherweise als Befestigungsmittel verwendet, das keine Autofluoreszenz aufweisen darf, farblos und transparent ist und die Helligkeit der Fluoreszenz bei pH 8,5-9,5 heller ist und nicht leicht schnell verblasst. Daher wird üblicherweise eine gleiche Mischung aus Glycerin und 0,5 mol/L Carbonatpufferlösung mit einem pH-Wert von 9,0 bis 9,5 als Montagemittel verwendet. Die
e. Spiegelöl
Bei der Beobachtung von Proben mit Dunkelfeld-Fluoreszenzmikroskopen und Ölimmersionsobjektiven muss grundsätzlich Immersionsöl verwendet werden. Am besten verwenden Sie spezielles nicht fluoreszierendes Spiegelöl, das auch durch das oben genannte Glycerin ersetzt werden kann, und auch flüssiges Paraffin kann verwendet werden, allerdings ist der Brechungsindex niedrig, was die Bildqualität leicht beeinträchtigt.
