Fluoreszenzbeobachtung mit einem optischen Mikroskop
Unter Fluoreszenz versteht man den Vorgang, bei dem ein fluoreszierender Stoff nahezu gleichzeitig Licht mit längerer Wellenlänge emittiert, wenn er mit Licht einer bestimmten Wellenlänge bestrahlt wird (Abbildung 1). Wenn Licht einer bestimmten Wellenlänge (Anregungswellenlänge) auf ein Molekül trifft, beispielsweise auf ein Fluorophor, wird die Photonenenergie von den Elektronen des Moleküls absorbiert. Als nächstes gehen die Elektronen vom Grundzustand (S0) in ein höheres Energieniveau, den angeregten Zustand (S1'), über. Dieser Vorgang wird als Anregung① bezeichnet. Das Elektron bleibt 10-9–10-8 Sekunden lang im angeregten Zustand, während dieser Zeit verliert das Elektron etwas Energie②. Während die Elektronen den angeregten Zustand (S1) verlassen und in den Grundzustand③ zurückkehren, wird die verbleibende Energie, die während des Anregungsprozesses absorbiert wurde, freigesetzt.
Fluoreszierendes Jablonski-Diagramm
Die Verweilzeit des fluoreszierenden Moleküls im angeregten Zustand ist die Fluoreszenzlebensdauer, die im Allgemeinen im Nanosekundenbereich liegt und eine inhärente Eigenschaft des fluoreszierenden Moleküls selbst ist. Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung (FLIM), die die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungstechnologie nutzt, kann zusätzlich zur Fluoreszenzintensitätsbildgebung detailliertere Funktionsmessungen durchführen und molekulare Konformationen, intermolekulare Wechselwirkungen und die Mikroumgebung von Molekülen usw. ermitteln. Informationen, die schwer zu ermitteln sind mit herkömmlicher optischer Bildgebung erhalten.
Eine weitere wichtige Eigenschaft der Fluoreszenz ist die Stokes-Verschiebung, der Wellenlängenunterschied zwischen den Anregungs- und Emissionspeaks (Abbildung 2). Typischerweise ist die Emissionswellenlänge länger als die Anregungswellenlänge. Dies liegt daran, dass Elektronen durch den Relaxationsprozess einen Teil ihrer Energie verlieren, nachdem die fluoreszierende Substanz angeregt wurde und bevor sie Photonen freisetzen. Fluoreszierende Substanzen mit größeren Stokes-Verschiebungen sind unter einem Fluoreszenzmikroskop leichter zu beobachten.
Fluoreszenzmikroskop
Das Fluoreszenzmikroskop ist ein optisches Mikroskop, das Fluoreszenzeigenschaften zur Beobachtung und Bildgebung nutzt und in verschiedenen Bereichen wie Zellbiologie, Neurobiologie, Botanik, Mikrobiologie, Pathologie und Genetik weit verbreitet ist. Die Fluoreszenzbildgebung hat die Vorteile einer hohen Empfindlichkeit und einer hohen Spezifität und eignet sich sehr gut für die Beobachtung der Verteilung spezifischer Proteine und Organellen in Geweben und Zellen, die Untersuchung von Kolokalisierung und Interaktion sowie die Verfolgung lebensdynamischer Prozesse wie Änderungen der Ionenkonzentration , usw.
Die meisten Moleküle in Zellen fluoreszieren nicht, und wenn Sie sie sehen möchten, markieren Sie sie mit einer Fluoreszenzmarkierung. Es gibt viele Methoden der Fluoreszenzmarkierung, z. B. die direkte Markierung (z. B. die Verwendung von DAPI zur Markierung von DNA), die Immunfärbung unter Verwendung der Antigenbindungseigenschaften von Antikörpern oder die Verwendung fluoreszierender Proteine (z. B. GFP, grün fluoreszierendes Protein) zur Markierung von Zielproteinen und reversible Bindung. synthetische Farbstoffe (wie Fura-2) usw.
Invertiertes Fluoreszenzmikroskop MF53-N
Gegenwärtig ist das Fluoreszenzmikroskop zur Standard-Bildgebungsausrüstung verschiedener Labore und Bildgebungsplattformen geworden und ein guter Helfer für unsere täglichen Experimente. Fluoreszenzmikroskope werden hauptsächlich in drei Kategorien unterteilt: aufrechte Fluoreszenzmikroskope (geeignet zum Schneiden), inverse Fluoreszenzmikroskope (geeignet für lebende Zellen, unter Berücksichtigung des Schneidens), Fluoreszenzstereoskope (geeignet für größere Proben wie Pflanzen, Zebrafische (Erwachsene/Embryonen). ), Medaka, Maus-/Rattenorgane usw.).
Die Bildgebungstechnologie der Fluoreszenzmikroskopie ist weit verbreitet und vielfältig, und es entstehen immer noch neue Technologien. Sie können die Technologie auswählen, um Ihre eigene Forschung durchzuführen.
