Die Fluoreszenzmikroskopie unterscheidet sich von der herkömmlichen Mikroskopie
Fluoreszenzmikroskope verwenden ultraviolettes Licht als Lichtquelle, um das zu untersuchende Objekt zu bestrahlen, sodass das Objekt Licht aussendet, und dann das Objekt unter dem Mikroskop zu beobachten. Es wird hauptsächlich für Immunfluoreszenzzellen verwendet. Es besteht im Wesentlichen aus einer Lichtquelle, einem Filterplattensystem und einem optischen System zur Beobachtung des Fluoreszenzbildes der Probe durch die Vergrößerung des Okulars und der Objektivlinse. Werfen wir einen Blick auf den Unterschied zwischen diesem Fluoreszenzmikroskop und einem gewöhnlichen optischen Mikroskop.
1. Schauen Sie sich die Beleuchtungsmethode an
Die Beleuchtungsmethode des Fluoreszenzmikroskops ist im Allgemeinen episkopisch, das heißt, die Lichtquelle wird durch die Objektivlinse auf die Testprobe projiziert.
2. Sehen Sie sich die Auflösung an
Fluoreszenzmikroskope verwenden ultraviolettes Licht als Lichtquelle. Die Wellenlänge ist relativ kurz, aber die Auflösung ist höher als bei gewöhnlichen optischen Mikroskopen.
3. Der Unterschied im Filter
Fluoreszenzmikroskope verwenden zwei spezielle Filter, die vor der Lichtquelle zum Herausfiltern von sichtbarem Licht und zwischen der Objektivlinse und dem Okular zum Herausfiltern von ultravioletten Strahlen eingesetzt werden, die das menschliche Auge schützen können.
Das Fluoreszenzmikroskop ist auch eine Art optisches Mikroskop, vor allem weil die vom Fluoreszenzmikroskop angeregte Wellenlänge kurz ist, was zu einem Unterschied in Struktur und Verwendung zwischen dem Fluoreszenzmikroskop und dem gewöhnlichen Mikroskop führt. Die meisten Fluoreszenzmikroskope verfügen über eine gute Fähigkeit, schwaches Licht einzufangen, so dass auch bei extrem schwacher Fluoreszenz die Abbildungsfähigkeit gut ist. In Verbindung mit der kontinuierlichen Verbesserung der Fluoreszenzmikroskope in den letzten Jahren konnte auch das Rauschen stark reduziert werden. Daher werden immer häufiger Fluoreszenzmikroskope eingesetzt.
Paar
Kenntnisse über Photonenfluoreszenzmikroskopie
Das Grundprinzip der Zwei-Photonen-Anregung ist: Bei hoher Photonendichte können fluoreszierende Moleküle zwei Photonen mit langer Wellenlänge gleichzeitig absorbieren und nach einer kurzen sogenannten Lebensdauer des angeregten Zustands ein Photon mit kürzerer Wellenlänge emittieren; Der Effekt ist derselbe, als würde man zur Anregung fluoreszierender Moleküle ein Photon mit einer Wellenlänge verwenden, die halb so groß wie die Langwellenlänge ist. Für die Zweiphotonenanregung ist eine hohe Photonendichte erforderlich. Um Zellen nicht zu schädigen, werden in der Zwei-Photonen-Mikroskopie hochenergetische modengekoppelte gepulste Laser eingesetzt. Der von diesem Laser emittierte Laser hat eine hohe Spitzenenergie und eine niedrige Durchschnittsenergie, seine Pulsbreite beträgt nur 100 Femtosekunden und seine Frequenz kann 80 bis 100 Megahertz erreichen. Bei Verwendung einer Objektivlinse mit hoher numerischer Apertur zur Fokussierung der Photonen des gepulsten Lasers ist die Photonendichte im Brennpunkt der Objektivlinse am höchsten und eine Zweiphotonenanregung erfolgt nur im Brennpunkt der Objektivlinse Das Zwei-Photonen-Mikroskop benötigt keine konfokale Lochblende, was die Effizienz der Fluoreszenzdetektion verbessert.
Bei allgemeinen Fluoreszenzphänomenen kann ein fluoreszierendes Molekül aufgrund der geringen Photonendichte des Anregungslichts nur ein Photon gleichzeitig absorbieren und dann durch einen Strahlungsübergang, bei dem es sich um eine Einzelphotonenfluoreszenz handelt, ein fluoreszierendes Photon emittieren. Beim Fluoreszenzanregungsprozess mit Laser als Lichtquelle kann Zwei-Photonen- oder sogar Mehrphotonen-Fluoreszenz auftreten. Zu diesem Zeitpunkt ist die Intensität der verwendeten Anregungslichtquelle hoch und die Photonendichte entspricht den Anforderungen fluoreszierender Moleküle, die zwei Photonen gleichzeitig absorbieren. Bei der Verwendung eines allgemeinen Lasers als Anregungslichtquelle reicht die Photonendichte immer noch nicht aus, um das Zwei-Photonen-Absorptionsphänomen zu erzeugen. Normalerweise wird ein gepulster Femtosekundenlaser verwendet, dessen Momentanleistung die Größenordnung von Megawatt erreichen kann. Daher ist die Wellenlänge der Zwei-Photonen-Fluoreszenz kürzer als die Wellenlänge des Anregungslichts, was dem Effekt entspricht, der durch Anregung bei der halben Anregungswellenlänge erzeugt wird.
Die Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie hat viele Vorteile:
1) Langwelliges Licht wird weniger durch Streuung beeinträchtigt als kurzwelliges Licht und dringt leichter in die Probe ein.
2) Die fluoreszierenden Moleküle außerhalb der Brennebene werden nicht angeregt, sodass mehr Anregungslicht die Brennebene erreichen kann, sodass das Anregungslicht tiefere Proben durchdringen kann;
3) Langwelliges Nahinfrarotlicht ist für Zellen weniger toxisch als kurzwelliges Licht.
4) Bei Verwendung eines Zwei-Photonen-Mikroskops zur Beobachtung von Proben treten Photobleichung und Phototoxizität nur in der Fokusebene auf. Daher eignet sich die Zwei-Photonen-Mikroskopie besser als die Ein-Photonen-Mikroskopie zur Beobachtung dicker Proben, zur Beobachtung lebender Zellen oder für punktuelle Photobleichexperimente.
Kenntnisse über konfokale Fluoreszenzmikroskopie
Das Grundprinzip der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie: Die Probe wird von einer punktförmigen Lichtquelle bestrahlt und es entsteht ein kleiner, wohldefinierter Lichtfleck auf der Fokusebene. Nachdem der Punkt bestrahlt wurde, wird die emittierte Fluoreszenz von der Objektivlinse gesammelt und entlang des ursprünglichen Beleuchtungspfads zum Strahlteiler zurückgeschickt, der aus einem dichroitischen Spiegel besteht. Der Strahlteiler sendet die Fluoreszenz direkt zum Detektor. Vor der Lichtquelle und dem Detektor befindet sich eine Lochblende, die als Beleuchtungslochblende bzw. Detektionslochblende bezeichnet wird. Die geometrische Größe der beiden ist gleich, etwa 100-200nm; relativ zum Lichtfleck auf der Brennebene sind die beiden konjugiert, das heißt, der Lichtfleck durchläuft eine Reihe von Linsen und kann schließlich gleichzeitig auf die Beleuchtungslochblende und die Detektionslochblende fokussiert werden. Auf diese Weise kann das Licht aus der Brennebene im Bereich des Detektionslochs gebündelt werden, während das Streulicht von oberhalb oder unterhalb der Brennebene außerhalb des Detektionslochs blockiert wird und nicht abgebildet werden kann. Der Laser scannt die Probe Punkt für Punkt, und die Photomultiplierröhre erhält nach der Erkennung der Lochblende auch Punkt für Punkt das konfokale Bild des entsprechenden Lichts, das in ein digitales Signal umgewandelt und an den Computer übertragen und schließlich zu einem klaren Bild aggregiert wird konfokales Abbild der gesamten Brennebene auf dem Bildschirm.
Jedes Brennebenenbild ist eigentlich ein optischer Querschnitt der Probe, und dieser optische Querschnitt hat immer eine bestimmte Dicke, die auch als optischer Dünnschnitt bezeichnet wird. Da die Lichtintensität am Brennpunkt viel größer ist als die am Nicht-Fokuspunkt und das Licht außerhalb der Brennebene durch die Lochblende herausgefiltert wird, beträgt die Schärfentiefe des konfokalen Systems ungefähr Null und die Abtastung erfolgt entlang der Mit der Z-Achse kann eine optische Tomographie realisiert werden, die einen zweidimensionalen optischen Schnitt am fokussierten Punkt der zu beobachtenden Probe erzeugt. Durch die Kombination des Scannens der XY-Ebene (Brennebene) mit dem Scannen der Z-Achse (optische Achse) kann das dreidimensionale Bild der Probe durch die Akkumulation zweidimensionaler Bilder kontinuierlicher Schichten erhalten und mit einer speziellen Computersoftware verarbeitet werden.
Das heißt, die Detektionslochblende und die Lichtquellenlochblende sind immer auf den gleichen Punkt fokussiert, so dass die außerhalb der Fokusebene angeregte Fluoreszenz nicht in die Detektionsblende gelangen kann.
Der einfache Ausdruck des Funktionsprinzips des konfokalen Lasers besteht darin, dass Laserlicht als Lichtquelle verwendet wird. Auf der Grundlage der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop-Bildgebung werden ein Laserscangerät und ein konjugiertes Fokussiergerät hinzugefügt, und es handelt sich um ein System zur digitalen Bilderfassung und -verarbeitung durch Computersteuerung.
