Merkmale und Anwendungen der konfokalen Lasermikroskopie
Das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop (LSCM) ist ein Mikroskoptyp, der auf der Technologie der konjugierten Fokussierung basiert, d.
Grundlegend
Bei allgemeinen Mikroskopen fällt die Brennebene der Objektivlinse mit dem Detektor zusammen, sodass die beobachtete Bildebene von der benachbarten axialen Ebene isoliert ist, während bei konfokalen Mikroskopen die Probe mit einem beugungsbegrenzten Lichtfleck beleuchtet wird Dieser Isolationseffekt wird durch die Verwendung einer Lochblende im Sammellichtweg am Brennpunkt des Spotkonjugats erreicht, um Streulicht zu filtern und so die Auflösung zu verbessern.
Bildgebungsfunktionen
Nur das von der konjugierten Probenschicht zurückreflektierte Licht kann das kleine Loch im Sammellichtpfad passieren, und die verbleibenden irrelevanten Probenschichtreflexionen werden durch das kleine Loch blockiert. Dies kann zu einer deutlichen Steigerung der Auflösung führen. Unten sehen Sie einen direkten Vergleich der mehrdimensionalen Fluoreszenzmikroskopie und der konfokalen Mikroskopie derselben dicken Probe. Wenn eine Reihe von Bildern in verschiedenen Fokusebenen aufgenommen wird, kann ein sogenannter „Z-Stapel“ erzeugt werden. Dieses Bild zeigt sowohl die Auflösungs- und Kontrastgewinne, die die konfokale Mikroskopie bietet, als auch die zugrunde liegenden Ursachen dieser Gewinne. Wenn man das Bild oben im Stapel untersucht, wobei sich die Bildebene über dem Gewebe befindet, erkennt man im Fluoreszenzbild viel Streulicht, während das konfokale Bild schwarz erscheint. Diese Verringerung der PSF in axialer Richtung ist direkt für den Unterschied in der Auflösung verantwortlich, der an der optischen Schnittstelle in der Mitte des Z-Stapels beobachtet wird.
Ein weiteres Merkmal der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie besteht darin, dass es sich um eine scannende Bildgebungstechnologie handelt. Die herkömmliche Weitfeldbeleuchtungstechnologie beleuchtet die gesamte Probe, sodass das Bild direkt mit bloßem Auge oder einem Detektor erfasst werden kann. LSCM verwendet jedoch einen Strahl oder mehrere fokussierte Strahlen, die zum Scannen und Abbilden durch die Probe laufen, und das resultierende Bild ist wird als optischer Abschnitt bezeichnet. Im Folgenden wird der Unterschied zwischen der herkömmlichen Weitfeldbeleuchtungsmethode und der konfokalen Laserscanning-Beleuchtungsmethode dargestellt.
Daher ist in der folgenden Abbildung eine praktische Arbeitsweise eines modernen konfokalen Mikroskops dargestellt. Das vom Laser emittierte Anregungslicht durchläuft einen dichroitischen Spiegel und scannt die Probe in x- und y-Richtung durch ein Paar vibrierender Spiegel. Die Anregung (oder Reflexion) des Probenlichts tritt durch die Lochblende in den PMT-Detektor ein und wird aufgezeichnet. Das aufgezeichnete Scanbild wird vom Computer rekonstruiert, um das tatsächliche Probenbild zu erhalten.
