Unterschiede sowie Vor- und Nachteile zwischen Transmissionsfluoreszenzmikroskopie und Reflexionsfluoreszenzmikroskopie
1. Transmissionsfluoreszenzmikroskop: Die Anregungslichtquelle wird über einen Kondensor durch das Probenmaterial geleitet, um Fluoreszenz anzuregen. Üblicherweise verwendete Dunkelfeldkonzentratoren oder gewöhnliche Konzentratoren können verwendet werden, um den Reflektor so einzustellen, dass er Anregungslicht und Seitenlicht auf die Probe umwandelt. Dies ist ein relativ altmodisches Fluoreszenzmikroskop. Sein Vorteil ist eine starke Fluoreszenz bei geringer Vergrößerung, während sein Nachteil darin besteht, dass seine Fluoreszenz mit zunehmender Vergrößerung schwächer wird. Daher eignet es sich besser für die Beobachtung größerer Probenmaterialien.
2. Fallstrahl-Fluoreszenzmikroskop: Hierbei handelt es sich um einen neuen Typ eines Fluoreszenzmikroskops, der in der Neuzeit entwickelt wurde. Im Gegensatz zum vorherigen Fall fällt das Anregungslicht von der Objektivlinse auf die Oberfläche der Probe, wobei dieselbe Objektivlinse als Beleuchtungskondensor und die Objektivlinse zum Sammeln der Fluoreszenz verwendet werden. Dem Strahlengang muss ein zweifarbiger Strahlteiler hinzugefügt werden, der mit dem Photouran einen Winkel von 45 Grad bildet. Das Anregungslicht wird in die Objektivlinse reflektiert und sammelt sich auf der Probe. Die von der Probe erzeugte Fluoreszenz und das von der Oberfläche der Objektivlinse und des Deckglases reflektierte Anregungslicht treten gleichzeitig in die Objektivlinse ein und kehren zum zweifarbigen Strahlteiler zurück, wo sie das Anregungslicht und die Fluoreszenz trennen. Das restliche Anregungslicht wird dann vom Sperrfilter absorbiert. Wenn unterschiedliche Kombinationen von Anregungsfiltern, zweifarbigen Strahlteilern und Sperrfiltern verwendet werden, können diese den Anforderungen verschiedener fluoreszierender Reaktionsprodukte gerecht werden. Die Vorteile dieses Fluoreszenzmikroskops sind eine gleichmäßige Ausleuchtung des Sichtfeldes, eine klare Abbildung und eine stärkere Fluoreszenz bei höherer Vergrößerung.
Die Vor- und Nachteile der Transmissionsfluoreszenzmikroskopie
Lichtquelle: Hochdruck-Quecksilberlampe oder Halogenlampe.
Spotlight-Spiegel: Verwendung eines Dunkelfeld-Spotlights zur Trennung von Anregung und Fluoreszenz.
Objektivlinse: Es kann jede Art von Objektivlinse verwendet werden.
Probe: Dünne Proben eignen sich besser für die Transmissionsbeobachtung.
Vorteile: ① Durch die Verwendung eines Dunkelfeldkondensors kann das Anregungslicht nicht in die Objektivlinse gelangen, wodurch sich leicht ein dunkler Hintergrund bilden und ein guter Kontrast erzielen lässt. Außerdem kann jede Objektivlinse zur Beobachtung verwendet werden. ② Bei Verwendung eines Objektivs mit geringer Vergrößerung ist es heller als ein reflektierendes Fluoreszenzmikroskop.
Nachteil: Mittelpunkt und Höhe des Strahlers müssen richtig eingestellt sein, sonst kann kein helles Fluoreszenzbild erzielt werden. Aufgrund der Brennweitenbegrenzung des Dunkelfeldstrahlers können dicke Glasobjektträger nicht verwendet werden. Der Beleuchtungsbereich des Sichtfeldes sollte nicht zu groß sein, da sonst die Fluoreszenzfarbe der fluoreszierenden Probe verblassen kann. Dicke oder undurchsichtige Proben sind nicht geeignet.
Die Vor- und Nachteile der reflektierenden Fluoreszenzmikroskopie
Lichtquelle: Hochdruck-Quecksilberlampe oder Halogenlampe.
Fokussierlinse: Da die Objektivlinse als Fokussierlinse dient, ist keine Fokussierlinse erforderlich.
Objektivlinse: Die verwendete Objektivlinse muss in der Lage sein, ausreichend ultraviolettes Licht durchzulassen und darf selbst keine Fluoreszenz erzeugen, ohne Einschränkung der numerischen Apertur.
Probe: Es können sowohl dicke als auch undurchsichtige Proben beobachtet werden.
Vorteile: ① Da die Objektivlinse auch als Scheinwerfer dient, ist keine große Anpassung erforderlich. ② Durch die Verwendung der Kolar-Beleuchtungsmethode können die Effekte von Apertur und Sichtfeldaperturen genutzt werden. Die numerische Apertur des Objektivs ist nicht begrenzt und es können auch bei hoher Vergrößerung hochauflösende Bilder erhalten werden. Dicke oder undurchsichtige Proben können ebenfalls sein beobachtet, und es können auch dicke Deckgläser verwendet werden. Andere Beobachtungsmethoden können auch mit reflektierter Fluoreszenz kombiniert werden, insbesondere mit der Phasendifferenzmethode und der Transmissionsdifferentialinterferenzmethode. Dadurch kann unnötiges Phänomen des Verblassens der Fluoreszenzfarbe vermieden werden.
Nachteil: Bei Verwendung eines Bodenvergrößerungsobjektivs ist das Bild relativ dunkel, daher muss ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur verwendet werden. Das Filtersystem muss Anregungslumineszenz und Fluoreszenz effektiv trennen.,
