Unterschied zwischen gewöhnlichem Mikroskop und Fluoreszenzmikroskop
Fluoreszenzmikroskope verwenden ultraviolettes Licht als Lichtquelle, um das zu inspizierende Objekt zu bestrahlen, so dass das Objekt Licht emittiert, und beobachten dann das Objekt unter dem Mikroskop. Es wird hauptsächlich für Immunfluoreszenzzellen verwendet. Es besteht hauptsächlich aus einer Lichtquelle, einem Filterplattensystem und einem optischen System, um das Fluoreszenzbild der Probe durch die Vergrößerung des Okulars und der Objektivlinse zu beobachten. Werfen wir einen Blick auf den Unterschied zwischen diesem Fluoreszenzmikroskop und einem gewöhnlichen optischen Mikroskop.
1. In Bezug auf Beleuchtungsmethoden
Das Beleuchtungsverfahren des Fluoreszenzmikroskops ist im Allgemeinen episkopisch, das heißt, die Lichtquelle wird durch die Objektivlinse auf die Testprobe projiziert.
2. In Bezug auf die Auflösung
Fluoreszenzmikroskope verwenden ultraviolettes Licht als Lichtquelle. Die Wellenlänge ist relativ kurz, aber die Auflösung ist höher als bei gewöhnlichen Lichtmikroskopen.
3. Der Unterschied im Filter
Das Fluoreszenzmikroskop verwendet zwei spezielle Filter, die vor der Lichtquelle verwendet werden, um sichtbares Licht herauszufiltern, und zwischen der Objektivlinse und dem Okular verwendet werden, um ultraviolettes Licht herauszufiltern, das das menschliche Auge schützen kann.
Das Fluoreszenzmikroskop ist auch eine Art optisches Mikroskop, hauptsächlich weil die vom Fluoreszenzmikroskop angeregte Wellenlänge kurz ist, was zu einem Unterschied in Struktur und Verwendung zwischen Fluoreszenzmikroskop und gewöhnlichem Mikroskop führt. Die meisten Fluoreszenzmikroskope haben eine gute Funktion zum Erfassen schwachen Lichts, sodass ihre Abbildungsfähigkeit auch bei extrem schwacher Fluoreszenz gut ist. Gepaart mit der kontinuierlichen Verbesserung der Fluoreszenzmikroskope in den letzten Jahren wurde auch das Rauschen stark reduziert. Daher kommen immer mehr Fluoreszenzmikroskope zum Einsatz.
Kenntnisse über Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie
Das Grundprinzip der Zwei-Photonen-Anregung ist: Bei hoher Photonendichte können fluoreszierende Moleküle zwei langwellige Photonen gleichzeitig absorbieren und nach kurzer Zeit der sogenannten Lebensdauer des angeregten Zustands ein kurzwelligeres Photon emittieren . ; Der Effekt ist der gleiche wie bei der Anregung eines fluoreszierenden Moleküls durch ein Photon, dessen Wellenlänge halb so lang ist. Die Zwei-Photonen-Anregung erfordert eine hohe Photonendichte. Um Zellen nicht zu schädigen, verwendet die Zwei-Photonen-Mikroskopie hochenergetische modengekoppelte gepulste Laser. Der von diesem Laser emittierte Laser hat eine hohe Spitzenenergie und eine niedrige Durchschnittsenergie, seine Impulsbreite beträgt nur 100 Femtosekunden und seine Frequenz kann 80 bis 100 Megahertz erreichen. Wenn eine Objektivlinse mit hoher numerischer Apertur verwendet wird, um die Photonen des gepulsten Lasers zu fokussieren, ist die Photonendichte im Brennpunkt der Objektivlinse am höchsten, und die Zwei-Photonen-Anregung tritt also nur im Brennpunkt der Objektivlinse auf Das Zwei-Photonen-Mikroskop benötigt keine konfokale Lochblende, was die Fluoreszenzdetektionseffizienz verbessert.
Bei allgemeinen Fluoreszenzphänomenen kann ein fluoreszierendes Molekül aufgrund der geringen Photonendichte des Anregungslichts nur ein Photon gleichzeitig absorbieren und dann ein fluoreszierendes Photon durch einen strahlenden Übergang emittieren, was eine Einzelphotonenfluoreszenz ist. Für den Fluoreszenzanregungsprozess unter Verwendung eines Lasers als Lichtquelle kann eine Zwei-Photonen- oder sogar Mehr-Photonen-Fluoreszenz auftreten. Zu diesem Zeitpunkt ist die Intensität der verwendeten Anregungslichtquelle hoch und die Photonendichte erfüllt die Anforderungen an fluoreszierende Moleküle, die gleichzeitig zwei Photonen absorbieren. Bei der Verwendung eines allgemeinen Lasers als Anregungslichtquelle reicht die Photonendichte immer noch nicht aus, um das Zwei-Photonen-Absorptionsphänomen zu erzeugen. Üblicherweise wird ein gepulster Femtosekundenlaser verwendet, dessen Momentanleistung die Größenordnung von Megawatt erreichen kann. Daher ist die Wellenlänge der Zwei-Photonen-Fluoreszenz kürzer als die Wellenlänge des Anregungslichts, was dem Effekt entspricht, der durch Anregung bei der halben Anregungswellenlänge erzeugt wird.
Die Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie hat viele Vorteile:
1) Langwelliges Licht wird weniger durch Streuung beeinflusst als kurzwelliges Licht und dringt leicht in die Probe ein;
2) Die fluoreszierenden Moleküle außerhalb der Fokusebene werden nicht angeregt, so dass mehr Anregungslicht die Fokusebene erreichen kann, so dass das Anregungslicht tiefere Proben durchdringen kann;
3) langwelliges nahes Infrarotlicht ist für Zellen weniger toxisch als kurzwelliges Licht;
4) Bei Verwendung eines Zwei-Photonen-Mikroskops zur Beobachtung von Proben treten Photobleichung und Phototoxizität nur in der Fokusebene auf. Daher ist die Zwei-Photonen-Mikroskopie besser geeignet als die Ein-Photonen-Mikroskopie, um dicke Proben, lebende Zellen oder punktuelle Photobleaching-Experimente zu beobachten.
Kenntnisse über konfokale Fluoreszenzmikroskopie
Das Grundprinzip der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie: Mit einer punktförmigen Lichtquelle wird die Probe bestrahlt und in der Fokusebene entsteht ein fein abgegrenzter kleiner Lichtfleck. bestehend aus Splittern. Der Strahlteiler schickt die Fluoreszenz direkt zum Detektor. Vor der Lichtquelle und dem Detektor befindet sich eine Lochblende, die Beleuchtungslochblende bzw. Detektionslochblende genannt wird. Die geometrische Größe der beiden ist gleich, etwa 100-200 nm; relativ zum Lichtfleck in der Fokusebene sind beide konjugiert, dh der Lichtfleck durchläuft eine Reihe von Linsen und kann schließlich gleichzeitig auf die Beleuchtungslochblende und die Detektionslochblende fokussiert werden. Auf diese Weise kann das Licht aus der Fokusebene in den Bereich des Detektionslochs gebündelt werden, während das Streulicht von oberhalb oder unterhalb der Fokusebene außerhalb des Detektionslochs blockiert wird und nicht abgebildet werden kann. Der Laser tastet die Probe Punkt für Punkt ab, und die Photomultiplier-Röhre erhält nach dem Erkennen der Lochblende ebenfalls Punkt für Punkt das konfokale Bild des entsprechenden Lichts, das in ein digitales Signal umgewandelt und an den Computer übertragen und schließlich zu einem klaren aggregiert wird konfokales Bild der gesamten Fokusebene auf dem Bildschirm .
Jedes Bild in der Brennebene ist tatsächlich ein optischer Querschnitt der Probe. Dieser optische Querschnitt hat immer eine gewisse Dicke, auch optischer Dünnschliff genannt. Da die Lichtintensität am Brennpunkt viel größer ist als am Nicht-Fokuspunkt und das Licht der Nicht-Brennebene durch die Lochblende gefiltert wird, ist die Schärfentiefe des konfokalen Systems ungefähr null und das Scannen entlang der Z -Achse kann eine optische Tomographie realisieren, die einen zweidimensionalen optischen Schnitt am fokussierten Punkt der Probe bildet. Durch Kombinieren des Scannens in der XY-Ebene (Brennebene) mit dem Scannen in der Z-Achse (optische Achse) kann das dreidimensionale Bild der Probe erhalten werden, indem zweidimensionale Bilder kontinuierlicher Schichten akkumuliert und durch eine spezielle Computersoftware verarbeitet werden.
Das heißt, das Detektionspinhole und das Lichtquellenpinhole werden immer auf denselben Punkt fokussiert, so dass die außerhalb der Fokusebene angeregte Fluoreszenz nicht in das Detektionspinhole eintreten kann.
Der einfache Ausdruck des Arbeitsprinzips des konfokalen Lasers besteht darin, dass es einen Laser als Lichtquelle verwendet und auf der Grundlage der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop-Bildgebung ein Laserscangerät und ein konjugiertes Fokussiergerät hinzufügt und ein System zur digitalen Bilderfassung ist Verarbeitung durch Computersteuerung.
