Bestimmung der Anzahl von Mikroorganismen - die direkte Zählmethode des Mikroskops!
Bakterienpopulationswachstum manifestiert sich durch eine Zunahme der Zellzahl oder eine Zunahme der Zellmasse. Die Verfahren zur Bestimmung der Zellzahl umfassen das Direktmikroskop-Zählverfahren, das Plattenkolonie-Zählverfahren, das photoelektrische Ölverhältnisverfahren, das Maximum-Probability-Verfahren und das Membranfiltrationsverfahren. Die Methoden zur Messung der Zellsubstanz umfassen die Bestimmung des Zelltrockengewichts, die Bestimmung bestimmter Zellbestandteile wie Stickstoff, RNA- und DNA-Gehalt und die Bestimmung von Metaboliten. Kurz gesagt, es gibt viele Methoden zur Messung des Wachstums von Mikroorganismen, jede mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen, und sollte entsprechend der spezifischen Situation ausgewählt werden. Dieses Experiment stellt hauptsächlich die direkte Zählmethode des Mikroskops vor, die üblicherweise in der Produktion und in der wissenschaftlichen Forschung verwendet wird.
1. Zweckanforderungen
1. Klären Sie das Prinzip des Blutbildes.
2. Beherrschen Sie die Methode zum Zählen von Mikroorganismen mit einem Blutzellenzähler.
2. Grundprinzipien
Die Mikroskop-Direktzählmethode ist eine einfache, schnelle und intuitive Methode, um eine kleine Menge Suspension der zu testenden Probe auf einem speziellen Glasobjektträger mit einer bestimmten Fläche und einem bestimmten Volumen (auch bekannt als Bakterienzähler) direkt zu zählen. Methoden. Gegenwärtig sind die im In- und Ausland üblicherweise verwendeten Bakterienzähler: Blutkörperchen-Zähltafel, Peteroff-Hauser-Bakterienzähler und Hawksley-Bakterienzähler usw. Sie können zum Zählen von Hefen, Bakterien, Schimmelpilzsporen und anderen Suspensionen verwendet werden das Grundprinzip ist das gleiche. Die letzten beiden Arten von Bakterienzählern haben ein Gesamtvolumen von 0,02 mm3, nachdem sie mit einem Deckglas abgedeckt wurden, und der Abstand zwischen dem Deckglas und dem Objektträger beträgt nur 0,02 mm, also das Öl Immersionsobjektive können verwendet werden, um kleine Zellen wie Bakterien zu beobachten und zu beobachten. zählen. Neben diesen Bakteriometern gibt es auch ein Schätzverfahren für das Verhältnis der Fläche des Abstrichs zur Fläche des direkt unter dem Mikroskop betrachteten Gesichtsfeldes, das allgemein zur bakteriologischen Untersuchung von Milch verwendet wird. Die Vorteile der Mikroskop-Direktzählmethode sind intuitiv, schnell und einfach zu bedienen. Der Nachteil dieser Methode ist jedoch, dass das Messergebnis meist die Summe aus toten und lebenden Zellen ist. Gegenwärtig gibt es einige Methoden, um diesen Mangel zu überwinden, wie die Kombination aus lebensfähigen Bakterien, die Mikrokammerkulturen (kurzzeitig) färben, und die Zugabe von Zellteilungsinhibitoren, um den Zweck zu erreichen, nur lebensfähige Bakterien zu zählen.
In diesem Experiment wurde ein Hämozytometer als Beispiel für die direkte mikroskopische Zählung verwendet. Für die Verwendung der anderen beiden Arten von Bakterienzählern beachten Sie bitte die Anweisungen des jeweiligen Herstellers. Das Zählen direkt unter dem Mikroskop mit einem Hämozytometer ist eine häufig verwendete Methode zum Zählen von Mikroorganismen. Die Zählplatte ist ein spezieller Glasschlitten, auf dem durch vier Schlitze drei Plattformen gebildet werden; Die breitere Plattform in der Mitte ist durch einen kurzen Querschlitz in zwei Hälften geteilt, und auf jeder Seite der Plattform befindet sich ein Gitter. Jedes Gitter ist in neun große Quadrate unterteilt, und das große Quadrat in der Mitte ist der Zählraum. Der Aufbau der Blutzellenzählplatte ist in Abbildung l{{{{10}}}} dargestellt. Der Maßstab des Zählraums hat im Allgemeinen zwei Spezifikationen, eine ist ein großes Quadrat, das in 25 mittlere Quadrate unterteilt ist, und jedes mittlere Quadrat ist in 16 kleine Quadrate unterteilt (Abbildung 15-2); das andere ist ein großes Quadrat. Das Quadrat ist in 16 mittlere Quadrate unterteilt, und jedes mittlere Quadrat ist in 25 kleine Quadrate unterteilt, aber egal um welche Art von Zählbrett es sich handelt, es gibt 400 kleine Quadrate in jedem großen Quadrat. Die Seitenlänge jedes großen Quadrats beträgt 1 mm, und die Fläche jedes großen Quadrats beträgt 1 mm2. Nach dem Abdecken mit einem Deckglas beträgt die Höhe zwischen dem Deckglas und dem Objektträgerglas 0,1 mm, sodass das Volumen der Zählkammer 0,1 mm3 (ein Tausendstel Milliliter) beträgt. Abbildung 15-1 Der Aufbau der Blutkörperchen-Zähltafel (1) Abbildung 15-2 Der Aufbau der Blutkörperchen-Zähltafel (2) A. Vorderansicht; B. Längsschnittansicht; Das vergrößerte Raster, das große Quadrat in der Mitte ist die Zählkammer 1. Blutkörperchen Zählplatte; 2. Deckglas; 3. Wenn Sie in der Zählkammer zählen, zählen Sie normalerweise die Gesamtzahl der Bakterien in fünf Quadraten, berechnen Sie dann den Durchschnitt jedes Quadrats und multiplizieren Sie es mit 25 oder 16, um die Gesamtzahl der Bakterien in einem großen Quadrat zu erhalten Gesamtzahl der Bakterien in 1 ml Bakterienlösung. Die Gesamtzahl der Bakterien in den fünf Quadraten sei A und das Verdünnungsverhältnis der Bakterienlösung B. Wenn es sich um eine Zählplatte mit 25 Quadraten handelt, ist die Gesamtzahl der Bakterien in 1 ml Bakterienlösung {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(pieces) Ebenso, wenn es sich um eine Zählplatte mit 16 mittleren Quadraten handelt, die Gesamtzahl der Bakterien in 1 ml Bakterienlösung=A/ 5×16×104×B=32000A·B (Stücke)
3. Ausrüstung
1. Bakterien
Saccharomyces cerevisiae
2. Instrumente oder andere Utensilien
Hämozytometer, Mikroskop, Deckglas, steriler Kapillartropfer.
4. Betriebsschritte
1. Herstellung einer Bakteriensuspension
Saccharomyces cerevisiae wurde mit steriler physiologischer Kochsalzlösung zu einer Bakteriensuspension geeigneter Konzentration verarbeitet.
2. Mikroskopzählraum
Vor dem Hinzufügen von Proben die Zählkammer der Zählplatte mikroskopisch inspizieren. Wenn Schmutz vorhanden ist, muss er vor dem Zählen gereinigt und getrocknet werden.
3. Probe hinzufügen
Decken Sie das saubere und trockene Hämozytometer mit einem Deckglas ab und verwenden Sie dann einen sterilen Kapillartropfer, um einen kleinen Tropfen der geschüttelten Saccharomyces cerevisiae-Suspension vom Rand des Deckglases fallen zu lassen, und lassen Sie die Bakterienlösung durch Kapillarosmose automatisch entlang der Lücke fließen. Beim Betreten des Zählraums kann der allgemeine Zählraum mit bakterieller Flüssigkeit gefüllt werden. Schütteln Sie bei der Probenahme zunächst die Bakterienlösung; Beim Hinzufügen von Proben dürfen keine Luftblasen in der Zählkammer entstehen.
4. Mikroskopzählung
Stehen Sie nach dem Hinzufügen der Probe 5 Minuten lang still, stellen Sie dann das Hämozytometer auf den Mikroskoptisch, finden Sie zuerst die Position der Zählkammer mit einem Mikroskop mit geringer Leistung und wechseln Sie dann zum Zählen zu einem Mikroskop mit hoher Leistung. Passen Sie die Intensität des Mikroskoplichts entsprechend an. Achten Sie bei Mikroskopen, die Spiegel zur Beleuchtung verwenden, darauf, nicht von einer Seite des Lichts abzuweichen, da sonst die quadratischen Linien des Zählraums nicht gut im Sichtfeld zu sehen sind, oder nur vertikale Linien oder horizontale Linien gesehen werden. Wenn sich herausstellt, dass die Bakterienlösung vor dem Zählen zu konzentriert oder zu verdünnt ist, muss die Verdünnung vor dem Zählen neu eingestellt werden. Im Allgemeinen erfordert die Probenverdünnung etwa 5 bis 10 Bakterien in jeder kleinen Zelle. Jede Zählkammer wählt 5 mittlere Zellen (optional 4 Ecken und eine mittlere Zelle in der Mitte) zum Zählen aus. Die auf der Gitterlinie liegenden Zellen werden generell nur auf der oberen und rechten Linie gezählt. Im Fall von Hefeknospung, wenn die Größe der Knospe die Hälfte der Mutterzelle erreicht, wird sie als zwei Bakterienzellen gezählt. Um eine Probe zu zählen, berechnen Sie den Bakteriengehalt der Probe, indem Sie den Mittelwert aus den beiden Zählkammern berechnen.
5. Waschen Sie das Blutbild
Spülen Sie die Blutkörperchen-Zähltafel nach Gebrauch mit Wasser im Wasserhahn ab, schrubben Sie nicht mit harten Gegenständen und trocknen Sie sie nach dem Waschen selbst oder mit einem Fön. Mikroskopische Untersuchung, um festzustellen, ob sich in jeder kleinen Zelle Restbakterien oder andere Sedimente befinden. Wenn es nicht sauber ist, muss es wiederholt gewaschen werden, bis es sauber ist.
