Biologische Mikroskopie des Volumens von Gewebeblöcken
Biomikroskopie Bis heute sind Eiskaltfixierung, gefrorene ultradünne Schnitte und gefrorene Trockenmanipulation Routinemethoden für Röntgenmikrofelder von Geweben und Zellen. Die Einzelheiten der Methode werden in den folgenden Punkten erläutert:
Biologische Mikroskope Mikroskope mit einer Kondensorlinse können auf und ab bewegt werden, um eine mittlere Helligkeit zu erreichen, oder die Blende des variablen Lichtexpanders kann verändert werden, um eine mittlere Helligkeit von 9b zu erreichen. Bei sonnigem Licht kann das Spektiv entsprechend angehoben und die Blende des variablen Lichts entsprechend vergrößert werden. Bei zu starkem Licht kann der Scheinwerferspiegel entsprechend abgesenkt und die Blende des variablen Lichts entsprechend verkleinert werden. Sollte das Licht in diesem Fall immer noch geblendet sein, können Sie einen geeigneten Filter in der Halterung unter dem Scheinwerfer auswählen. So können Sie die Helligkeit so einstellen, dass Sie mit der gewünschten Zufriedenheit zufrieden sind. Natürlich können Sie durch die Einstellung der oberen und unteren Position der Kondensorlinse die Größe der Blendenöffnung variieren, je nach Lichteinfall und Auswahl geeigneter Filter, aber das gelingt nach einer gewissen Zeit der Übung und Erfahrung.
Biologisches Mikroskop Ein sehr wichtiger Punkt ist der Prozess der Probenentnahme und Trennung von Zellen, der Gefriertrocknung und der Harzeinbettung (FD) nach dem Einfrieren von Ultrabroschüren. Nach der Gefriertrocknung muss der Feindurchlauf jedes Teils der 65 Elementzusammensetzung sehr sorgfältig gehandhabt werden und die zu beobachtenden und analysierenden Zellen dürfen nicht beschädigt werden. Da die Röntgenmikrobereichsanalyse nicht nur viele Schritte umfasst, sondern auch sehr teuer ist, ist es sehr bedauerlich, die falschen Schlussfolgerungen zu ziehen, wenn sich nach langer Zeit und vielen Verarbeitungsschritten herausstellt, dass es sich bei den analysierten Zellen um beschädigte oder tote Zellen handelt. Beispielsweise weisen die durch die Kollagenasebehandlung isolierten Kardiomyozyten zwei Morphologien auf, eine ist lang stäbchenförmig und die andere rund. Bei letzteren handelt es sich um absterbende Zellen, die während der Zellisolierung beschädigt wurden.
Biomikroskopie Der Gehalt und die Verteilung der Elektrolyte in diesen beiden Zelltypen sind sehr unterschiedlich. In den runden Kardiomyozyten war Na sehr hoch und K sehr niedrig, und die Ca-Konzentration war in den Mitochondrien sehr hoch. Nach Überprüfung mit anderen Analysemethoden zeigte sich, dass der hohe Na- und niedrige K-Gehalt in den runden Zellen und der hohe Ca-Gehalt in den Mitochondrien das Ergebnis einer Beschädigung der Zellmembran während der Zelltrennung waren. Die Kaltfixierung von Zellen und Geweben erfolgt häufig durch Abschreckfixierung, gefolgt von einer Konservierung in flüssigem Stickstoff. Die Abschreckfixierung ist wichtig für die Wirksamkeit der Konservierung. Lebende Zellen oder frisches Gewebe sind reich an Wasser. Beim Abschrecken kommen die Zellen oder Gewebe und das Kältemittel (insbesondere bei flüssigem Stickstoff reine Kälte) häufig in direkten Kontakt mit den Teilen der ersten Gefrierfixierung und bilden so eine „Hülle“, die die Kaltfixierung des Zellzentrums verhindert. Infolgedessen werden bei der Röntgenmikrozellanalyse häufig Eiskristalle im Zentrum größerer Zellen gefunden. Um dies zu verhindern, werden als Kühlmittel Substanzen verwendet, deren Schmelzpunkt höher als der von flüssigem Stickstoff, aber niedriger als 806 °C (trocken) ist. Es gibt viele solcher Substanzen, aber konzentriertes Propan ist leicht zu beschaffen, günstig (Siedepunkt 42,12 °C, Schmelzpunkt 187,1 °C, Molekulargewicht 44,1), die Abkühlrate ist schnell. Es hat jedoch den Nachteil, dass es entflammbar ist.
Unter einem biologischen Mikroskop können die Muskelfasern auf ein spezielles Gestell gestellt werden. Die Muskelfasern müssen nach einer bestimmten Zeit kontrahiert werden, um fixiert zu werden. Dann wird die Düse sofort eingeschaltet und das Flüssiggas wird auf die Muskelfasern gesprüht, damit sie durch Kaltabschrecken fixiert werden. Anschließend werden die Muskelfasern zusammen mit dem Gestell herausgenommen und in flüssigen Stickstoff gegeben. Wenn Blutzellen oder isolierte Zellen fixiert werden sollen, werden die Zellen zunächst durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit konzentriert. Anschließend werden die Zellen in ein Silberröhrchen mit guter Wärmeleitfähigkeit überführt und das Röhrchen in das Flüssiggas gegeben, um die Faser kalt zu fixieren. Im Hall-Labor wird die Bauchspeicheldrüse von Ratten fixiert. Die beiden Stahlstücke werden zunächst mit flüssigem Helium (oder flüssigem Stickstoff) vorgekühlt. Die beiden Kupferstücke werden mit einer Klammer vor und hinter der Bauchspeicheldrüse platziert, damit die Drüsen durch Kaltabschrecken fixiert werden. Nach dem Abschrecken und Fixieren können die Gewebe oder Zellen lange Zeit in flüssigem Stickstoff gelagert werden.
