Eine Bewertung verschiedener hochauflösender Mikroskopiemethoden
Bei der konventionellen Lichtmikroskopie begrenzt die Lichtbeugung die Bildauflösung auf etwa 250 nm. Heutzutage können hochauflösende Techniken dies um mehr als den Faktor 10 verbessern. Diese Technik wird hauptsächlich durch drei Methoden erreicht: Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie, einschließlich lichtempfindlicher Lokalisierungsmikroskopie (PALM) und stochastischer optischer Rekonstruktionsmikroskopie (STORM); Strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM); und stimulierte Emissionsverarmungsmikroskopie (STED). Die Wahl der Super-Resolution-Technologie ist für jeden von Bedeutung. „Leider gibt es keine einfachen Prinzipien für die Entscheidung, welche Methode verwendet werden soll“, sagt Mathew Stracy, Postdoktorand an der Universität Oxford, Großbritannien. „Jedes hat seine eigenen Vor- und Nachteile.“ Natürlich überlegen Wissenschaftler auch, wie sie für ein bestimmtes Projekt die richtige Methode auswählen können. „Im Zusammenhang mit der Biobildgebung sind folgende Schlüsselfaktoren zu berücksichtigen: räumliche und zeitliche Auflösung, Empfindlichkeit gegenüber Lichtschäden, Markierungskapazität, Probendicke und Hintergrundfluoreszenz oder zellautologe Fluoreszenz.“ Wie es funktioniert Die verschiedenen hochauflösenden Mikroskope funktionieren auf unterschiedliche Weise. Im Fall von PALM und STORM wird zu einem bestimmten Zeitpunkt nur ein kleiner Teil der Fluoreszenzmarker angeregt oder photoaktiviert, was ihre unabhängige Lokalisierung mit hoher Präzision ermöglicht. Das Durchlaufen dieses Prozesses mit allen fluoreszierenden Markierungen führt zu einem vollständigen hochauflösenden Bild.
Stefan Hell, einer der Nobelpreisträger für Chemie 2014 und Direktor des Max-Planck-Instituts für biophysikalische Chemie, sagte: „Das PALM/STORM-System ist relativ einfach einzurichten, aber aufgrund der Fluoreszenz schwierig anzuwenden.“ Die Gruppe muss über die Fähigkeit zur Photoaktivierung verfügen. Einschränkungen Der Nachteil besteht darin, dass sie ein einzelnes fluoreszierendes Molekül im Kontext einer Zelle erkennen müssen und weniger zuverlässig sind als STED. STED verwendet einen Laserpuls, um das Fluorophor anzuregen, und einen ringförmigen Laser, um das Fluorophor zu löschen, sodass nur die mittlere Fluoreszenz im Nanometerbereich für die Superauflösung übrig bleibt. Durch das Scannen der gesamten Probe entsteht ein Bild. „Der Vorteil von STED besteht darin, dass es sich um eine Technologie auf Knopfdruck handelt“, erklärte Hell. „Es funktioniert wie ein herkömmliches konfokales Fluoreszenzmikroskop.“ Es kann auch lebende Zellen mithilfe von Fluorophoren wie grün oder gelb fluoreszierenden Proteinen und von Rhodamin abgeleiteten Farbstoffen abbilden. Parametrischer Vergleich Obwohl alle Super-Resolution-Techniken die konventionelle Lichtmikroskopie hinsichtlich der Auflösung übertreffen, unterscheiden sie sich voneinander. SIM verdoppelt die Auflösung ungefähr auf etwa 100 nm. PALM und STORM können 15-nm-Ziele auflösen. Laut Hell bietet STED eine räumliche Auflösung von 30 nm in lebenden Zellen und 15 nm in fixierten Zellen. Wenn es um bestimmte Anwendungen geht, müssen wir auch das Signal-Rausch-Verhältnis berücksichtigen.
In einigen Fällen kann eine niedrigere Auflösung, aber ein höheres SNR zu einem besseren Bild führen als das Gegenteil (höhere Auflösung, aber ein niedrigeres SNR). Besonders bei lebenden Zellen ist auch die Geschwindigkeit der Bildaufnahme sehr wichtig. „Alle hochauflösenden Techniken sind langsamer als herkömmliche Fluoreszenzbildgebungstechniken“, sagte Stracy. „PALM/STORM ist am langsamsten, es benötigt Zehntausende Bilder, um ein einzelnes Bild zu erhalten, SIM benötigt Dutzende Bilder und STED ist eine Scan-Technologie, daher hängt die Aufnahmegeschwindigkeit von der Größe des Sichtfelds ab.“ Neben lebenden Zellen oder feststehenden Zellen wollen manche Wissenschaftler auch verstehen, wie sich Objekte bewegen. Stracy interessiert sich für das Verständnis der Dynamik biologischer Systeme in lebenden Zellen und nicht nur für statische Bilder. Er kombiniert PALM mit Einzelpartikel-Tracking, um die Dynamik in lebenden Zellen zu analysieren. Auf diese Weise kann er die Markermoleküle bei der Ausübung ihrer Funktion direkt verfolgen. Er ist jedoch der Ansicht, dass sich SIM nicht für die Untersuchung dieser dynamischen Prozesse auf molekularer Ebene eignet, sondern aufgrund seiner schnellen Erfassungsgeschwindigkeit besonders für die Beobachtung der Dynamik größerer Strukturen, beispielsweise ganzer Chromosomen, geeignet ist.
Die neuesten Ergebnisse Im Jahr 2017 berichtete Hells Team in Science über das hochauflösende MINFLUX-Mikroskop. Mit dieser Super-Resolution-Methode wird laut Hell erstmals eine Ortsauflösung von 1 nm erreicht. Darüber hinaus können einzelne Moleküle in lebenden Zellen mindestens 100-mal schneller verfolgt werden als mit anderen Methoden. Auch andere Wissenschaftler lobten das MINFLUX-Mikroskop. „Es werden ständig neue Anwendungen und Ansätze entwickelt, aber zwei Fortschritte fallen mir besonders auf“, sagte Shechtman. Einer davon ist MINFLUX. „Es nutzt einen genialen Ansatz, um eine sehr präzise molekulare Positionierung zu erreichen.“ Bezüglich der zweiten spannenden Entwicklung erwähnte Shechtman WE Moerner und seine Kollegen an der Stanford University. Moerner war außerdem Träger des Nobelpreises für Chemie 2014. Einer der Gewinner. Um die durch die anisotrope Streuung fluoreszierender Einzelmoleküle verursachte Einschränkung der Bildauflösung zu beheben, verwendeten die Wissenschaftler unterschiedliche Anregungspolarisationen, um die Ausrichtung und Position der Moleküle zu bestimmen. Darüber hinaus haben sie empfindliche Pupillenoberflächen entwickelt. Diese Techniken verbessern die Fähigkeit, Strukturen zu lokalisieren. Über fluoreszierende Etiketten In vielen hochauflösenden Anwendungen sind Etiketten wirklich wichtig. Es gibt auch einige Unternehmen, die verwandte Produkte anbieten.
Beispielsweise hat sich das deutsche Unternehmen Miltenyi mit Abberior, einem von Stefan Hell gegründeten Unternehmen, zusammengetan, um maßgeschneiderte Antikörperkonjugationsdienste für hochauflösende Mikroskopiefarbstoffe anzubieten. Auch eine Reihe anderer Unternehmen bieten passende Marker an. „Unsere Nano-Booster sind sehr klein, nur 1,5 kDa und hochspezifisch“, sagt Christoph Eckert, Marketingleiter bei ChromoTek. Diese Proteine binden grün und rot fluoreszierende Proteine (GFP und RFP). Sie werden aus Alpaka-Antikörperfragmenten, bekannt als VHH oder Nanobodies, mit hervorragenden Bindungseigenschaften und stabiler Qualität ohne Schwankungen von Charge zu Charge abgeleitet. Diese Marker eignen sich für verschiedene Super-Resolution-Techniken, darunter SIM, PALM, STORM und STED. Ai-Hui Tang, Assistenzprofessor an der University of Maryland School of Medicine, und Kollegen nutzten den GFP-Booster und STORM von ChromoTek, um die Informationsverbreitung im Nervensystem zu erforschen. Sie fanden molekulare Nanocluster, sogenannte Nanosäulen, in präsynaptischen und postsynaptischen Neuronen. Die Wissenschaftler glauben, dass diese Struktur zeigt, dass das Zentralnervensystem einfache Prinzipien nutzt, um die synaptische Effizienz aufrechtzuerhalten und zu regulieren. Verschiedene Versionen der hochauflösenden Bildgebung und eine wachsende Zahl von Methoden führen Wissenschaftler noch tiefer in biologische Geheimnisse. Indem sie die Beugungsgrenze des sichtbaren Lichts durchbrechen, können Biologen sogar die Aktivitäten von Zellen „genau überwachen“.
