Weiterentwicklungsvorteile von Laser-Scanning-Multiphotonenmikroskopen
Das Laser-Scanning-Multiphotonenmikroskop stellt eine wesentliche Verbesserung der optischen Mikroskopie dar, die sich vor allem in der Fähigkeit manifestiert, tiefe Strukturen lebender Zellen, fester Zellen und Gewebe zu beobachten und klare und scharfe mehrschichtige Z--Ebenenstrukturen, nämlich optische Schnitte, zu erhalten, die zur Konstruktion dreidimensionaler fester Strukturen von Proben verwendet werden können. Das konfokale Mikroskop verwendet eine Laserlichtquelle, die erweitert wird, um die gesamte Brennebene der Objektivlinse auszufüllen, und dann durch das Linsensystem der Objektivlinse in sehr kleine Punkte auf der Brennebene der Probe konvergiert. Entsprechend der numerischen Apertur der Objektivlinse beträgt der Durchmesser des hellsten Beleuchtungspunkts etwa 0,25-0,8 μm und die Tiefe etwa 0,5-1,5 μm. Die Größe des konfokalen Punktes wird durch das Mikroskopdesign, die Laserwellenlänge, die Objektiveigenschaften, die Zustandseinstellungen der Scaneinheit und die Probeneigenschaften bestimmt. Der Beleuchtungsbereich und die Tiefe eines Feldmikroskops sind groß, während die Beleuchtung eines konfokalen Mikroskops auf einen sicheren Brennpunkt in der Brennebene fokussiert ist. Der grundlegendste Vorteil der konfokalen Mikroskopie besteht darin, dass sie feine optische Schnitte an dicken fluoreszierenden Proben (bis zu 50 μm oder mehr) mit einer Dicke von etwa 0,5 bis 1,5 μm durchführen kann. Die Serie optischer Schnittbilder kann durch Auf- und Abbewegen der Probe mithilfe des Z--Achsen-Schrittmotors des Mikroskops erhalten werden. Die Erfassung der Bildinformationen erfolgt innerhalb einer sicheren Ebene und wird nicht durch Signale gestört, die von anderen Stellen der Probe ausgehen. Nachdem der Einfluss der Hintergrundfluoreszenz entfernt und das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht wurde, werden Kontrast und Auflösung konfokaler Bilder im Vergleich zu herkömmlichen Fluoreszenzbildern mit Feldbeleuchtung deutlich verbessert. In vielen Proben verflechten sich komplizierte Strukturkomponenten zu komplexen Systemen, aber sobald genügend optische Schnitte gesammelt werden können, können wir sie mithilfe von Software dreidimensional rekonstruieren. Diese experimentelle Methode wird in der biologischen Forschung häufig eingesetzt, um die komplexen strukturellen und funktionellen Beziehungen zwischen Zellen oder Geweben aufzuklären.
